Användning av enda molekyl fluorescerande i Situ hybridisering (SM-fisk) för att kvantifiera och lokalisera mRNA i murina oocyter

Denna teknik möjliggör inte bara lokalisering, men också kvantisering av kandidat mRNAs i de enskilda oocyter och embryon. Jämfört med andra analyser, inklusive PCR, resulterar färdigställande av tekniken i reproducerbara data med låg variation. Visar förfarandet kommer att Kelsey Timme, en doktorand i mitt laboratorium.

Påbörja denna procedur med beredning av erforderligt material och honmöss vid fem till åtta veckors ålder enligt beskrivningen i textprotokollet. Rengör musen med hjälp av 70%etanol. Exponera bukhålan och visualisera den kvinnliga reproduktionskanalen.

Håll äggstocken med tärna och ta bort livmoderns ligament och överflödig fettvävnad från runt äggstocken. Skär äggleden från livmodern. Placera sedan äggstocksoviduct-paret i varmt holdingmedium i en 35 millimeters maträtt.

Ta bort äggstocken och eventuell omgivande fettvävnad. Riv den svullna ampullae av oviduct med hjälp av en halv tum 27 gauge nål. Tryck oviduct på platsen för tår och cumulus cell oocyte komplex kommer att utvisas.

Med hjälp av en munpipett för att överföra de äggstockade äggcellerna till 100 mikroliterdroppen som innehåller holdingmedium med hyaluronidas. För att rubba cumulusceller, pipettera metafasen två oocyt cumulus cell komplex upp och ner i hyaluronidase som innehåller innehav medium med mun pipetten. När de är utan cumulus celler, använd mun pipetten för att överföra varje äggcell till en tvätt droppe som endast innehåller innehav medium.

Upprepa detta för varje tvättdropp. Överför inte fragmenterade eller genomskinliga oocyter. För att utföra SM-FISH färgning, först fixera oocyter i en enskild brunn av en sex brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter av fixeringsbuffert.

Submerge 20 oocyter eller mindre i brunnen. Inkubera oocyterna i fixeringsbuffert i 20 minuter i rumstemperatur. Efter tvättning av oocyterna enligt beskrivningen i textprotokollet inkubera oocyter i permeabliseringsbuffert i 30 minuter vid rumstemperatur.

Efter en annan tvätt, överför oocyterna till 80 mikroliter av prespättade proteas tre buffert i 30 minuter vid rumstemperatur. Späd de uppvärmda sonderade uppsättningarna för Nanog, Pou5f1 och DapB en till 50 i sondutspädningsvätska. Inkubera oocyter i 80 mikroliter av avskriften specifika sonden i två timmar vid 40 grader Celsius.

När oocyter är i sonden och AMP-buffertarna tenderar de att flyta. Det är viktigt att du dränka oocyterna genom att försiktigt trycka in dem i bufferten. Överför oocyterna till 500 mikroliter av tvättbuffert och inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.

Nu, inkubera äggceller sekventiellt i förstärkningsbuffertar. Först inkubera oocyter i 80 mikroliter av AMP1 i 30 minuter vid 40 grader Celsius. Överför sedan oocyterna till 500 mikroliter av tvättbuffert i 10 minuter vid rumstemperatur.

Därefter inkubera äggceller i 80 mikroliter av AMP2 i 15 minuter vid 40 grader Celsius. Efter tvättning av oocyterna som tidigare, inkubera oocyterna i 80 mikroliter av AMP3 i 30 minuter vid 40 grader Celsius följt av en sluttvätt. Slutligen, tillsätt äggceller till 80 mikroliter av AMP4FL i 15 minuter vid 40 grader Celsius.

Pipett 12 mikroliter av anti-fade monteringsmedium på mitten av en bild utan att lägga till bubblor till reagensen. Överför oocyter med så lite tvättbuffert som möjligt till monteringsmediet. Slutligen, tillämpa en cover slip.

Avbilda de tre dimensionella oocyterna med hjälp av Z-stegs konfokalmikroskopi och spara bilderna enligt beskrivningen i textprotokollet. Dra ND2 filer till Fiji och välj Hyperstack. Klicka på fliken Bild, välj Färg och klicka på Dela kanaler om du vill separera lysrörskanalerna i ND2-filen.

Generera enskilda TIFF-filer för varje Z-skiva av oocyterna i varje fluorescerande kanal. Gör det genom att klicka på fliken Bild, välja Staplar och klicka på Stapla till bilder. Klicka sedan på fliken Bild, välj Typ och klicka på RGB-färg för att konvertera varje Z-segment till en individuell RGB-färgbild.

Spara varje konverterad bild som en TIFF-fil. Placera bilder från en enda äggcell för varje fluorescerande kanal i en ny mapp för att undvika förvirring under syning. Efter att ha normaliserat filerna enligt beskrivningen i textprotokollet klickar du på fliken Plugins, väljer Stitching och klickar på Grid Collection.

Välj Sekventiella bilder på dropdown-menyn och klicka på Okej. Bläddra i katalogen och välj mappen som innehåller alla Z-segmentsbilder för en enskild äggcell vid en våglängd. Klicka på Okej.

Flytta reglaget längst ned på den sydda bilden till lämplig färgkanal för den våglängd som används. Skapa den slutliga RGB-sydda bilden genom att klicka på Bild, välja Typ och klicka på RGB-färg. Konvertera den sydda bilden till en 32-bitars maximal projicerad bild.

Om du vill göra det klickar du på Bild, väljer Typ och klickar på 32-bitars. Spara den här bilden som en ny TIFF-fil. Öppna den 32-bitars sydda bilden i ett program för att hitta och spåra plats.

Välj dropdown för Lokalisera och klicka på Lokalisera, som kommer att beräkna antalet fläckar som finns i bilden. Visas här är kvantifiering av mRNAs med hjälp av plats finder och spårning. Den blå pilen pekar på en positiv signal över tröskelvärdet.

Den vita pilen visar en lysrörsplats under tröskeln och därför inte räknas. MRNA-räkningarna analyserades därefter med hjälp av ett standardverktyg för dataanalys. Representativa bilder av bilden i den mellersta Z-serien visas för Pouf51 och Nanog.

DAPI-färgning av kromosomer som är i linje på metafasen två spindel visas i vitt. De uppgifter som samlats in i detta protokoll visade 775 Pouf51 avskrifter och 113 Nanog avskrifter i metafas två oocyter. Viktigt, det fanns inga fläckar upptäcks i äggceller som är märkta med DapB sond, som fungerade som den negativa kontrollen.

Vid användning av icke-vidhäftande celler är det viktigt att empiriskt identifiera den bästa utspädningen av proteasbuffert från SM-FISH-kitet. mRNA-detektering testades med hjälp av en titreringskurva av outspädda och flera utspädda proteasbuffertkoncentrationer i 1xPBS. Proteas utspädning som används i detta protokoll var en till åtta som det visade den lägsta variationen i den genomsnittliga fluorescerande uttryck för Pouf51 mRNA i metafas två oocyter.

Samtidig immunfluorescens av ett målprotein kan utföras för att samlokalisera mRNA med ett RNA-bindningsprotein. Samlokalisering av mRNAs med RNA-bindande proteiner gör det möjligt för utredare att bestämma mekanismer som reglerar mRNA lagring, översättning och nedbrytning inom en äggcell eller embryo.