Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם
Chapters
Summary May 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, פרוטוקול כמותי בזמן אמת מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז מוצגת לצורך קביעת התוכן המקורי מיקרו-RNA (מוחלט/יחסי) של חלקיקים ליפופרוטאין. בנוסף, שיטה להגברת רמת מיקרו RNA, כמו גם שיטה לקביעת שיעור ספיגת הסלולר של חלקיקים ליפופרוטאין, מומחש.
Transcript
חלקיקי ליפופרוטאין הם כלי תחבורה מקומיים. העשרת חומרים זרים מקלה על השימוש בהם כנשאי מסלול. תיוג ספציפי של מולקולות או חלקיקים שלמים מאפשר למדוד את ספיגת התאים.
שתי שיטות העשרה הן מהירות וקלות לשימוש, ו ניתן להתאים אותן למגוון רחב של חומרים. הדגימה של ההליך תהיה מרקוס אקסמן ואנדראס קרנר, שני פוסט-דוקים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל delipidation ברדס אדים, לערבב אחד עד שני מיליליטר של פתרון HDL מוכן המכיל חמישה מיליגרם של חלקיקי HDL עם 50 מיליליטר של תערובת מקורר מראש של שלושה עד שניים של אתנול diethyl אתר בצינור צנטריפוגה חרוטי.
דגירה במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס שליליות. צנטריפוגה ב 2500 פעמים g במשך 10 דקות ב שלילי 10 מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי, השליכו מחדש את גלולת הכדור ב-50 מיליליטר של תערובת אתנול דיאתיל אתר מקוררת מראש, ומערבולת לזמן קצר.
דגירה בפעם השנייה במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס שליליות. צנטריפוגה שוב ב 2500 פעמים g במשך 10 דקות ב שלילי 10 מעלות צלזיוס. ואז להכניס צינורות המספקים זרימת גז חנקן לייבש את גלולה.
ולהשתמש בו מחדש ב 250 microliters של חיץ A.לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקה חלבון ברדפורד או אחר מתאים. זה קריטי כדי להסיר את כל שרידים של תערובת האתר diethyl אתנול, כמו ממיסים אלה יעכבו את ההשתנות של אפוליפופרוטאינים. לאחר מכן, לדלל לריכוז סופי של מיליגרם אחד של חלבון לכל 250 microliters של חיץ A.Insert צינור אספקת גז אינרטי לחלק הפתרון בצינור.
במידת הצורך, יש לאחסן את הפתרון למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירת הגז האנרטי. כדי להתחיל בהשבתה, בצינור זכוכית נקי, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של CO, 13.5 מיקרוליטרים של C ו-500 מיקרוליטרים של מחשב. לאחר מכן לסובב את צינור הזכוכית תוך שטיפת גז חנקן בתוך הצינור כדי לייבש את התערובת על מנת להניב שכבת משטח הומוגנית. בצינור תגובה 0.5 מיליליטר, להכין פתרון זרע טרי 30 מילימולר במאגר A.Then לערבב 100 microliters של microRNA סינתטי 10 מיקרומולר עם 100 microliters של תותב זרע בצינור תגובה שני מיליליטר.
ודגירה במשך 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את פתרון 200 מיקרוליטר דגירה לתוך צינור הזכוכית כדי rehydrate שכבת משטח PC-CO-C המוכן Mastermix. ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של 30 מיליגרם לכל תווית נתרן deoxycholate מיליליטר.
מערבבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של פתרון HDL מתלבט לתוך צינור הזכוכית. ומערבבים בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.
כדי להתחיל בדיאליזה, תחילה להוסיף 50 גרם של חרוזים ספוגים ל 800 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. ולהשתמש בערבב מגנטי כדי לבחוש במשך דקה אחת. המתן 15 דקות עד שהחורוזים יתיישבו, ויתקעו את העל-טבעי.
חזור על ההליך עם PBS מקורר מראש. קלטות דיאליזה טרום רטובות ב- PBS. השתמש במזרק כדי להוסיף את התערובת שהוכנה בעבר לתוך הקלטות בהתאם להוראות היצרן.
הוסיפו את גם פרעזי ה-PBS המטופלים ב-PBS לשלושה ליטרים של PBS, והצבו את הקלטות ב-PBS כדי להנייד בארבע מעלות צלזיוס. חרוזים לשמור על שיפוע הצפיפות לאורך קרום הדיאליזה קבוע. שנה את המאגר ואת חרוזים לאחר שעה ושעה.
לאחר 24 שעות, עם מזרק, לחלץ את הפתרון מן הקלטת לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר כדי לשחזר את פתרון חלקיקי HDL מחדש. לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות ההתזה ברדפורד. לספק גז אינרטי לצינור התגובה, לאטום אותו, ולאחסן את פתרון חלקיקי HDL מחדש תחת אטמוספרת גז אינרטי בארבע מעלות צלזיוס.
ראשית, להכין פתרון זרע טרי 30 מילימולר במים ללא RNAse. מערבבים 100 מיקרוליטרים של 10 מיקרומולרים של מיקרו-רנ"א סינתטי עם 100 מיקרוליטרים של תותב זרע בצינור תגובה של שני מיליליטר. ודגירה במשך 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של DMSO ו-1.2 מיליליטר של מאגר LDL 1X לתתסרון הזרע המיקרו-רנ"א המוכן. לדלל פתרון חלקיקי LDL שהוכן בעבר עם PBS לריכוז סופי של כארבעה מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן צייר 450 מיקרוליטרים של הפתרון המדולל לצינור תגובה של 1.5 מיליליטר, וערבב עם 50 מיקרוליטרים של מאגר LDL 10X.
דגירה זה במשך 10 דקות על קרח. לאחר הדגירה, שלבו את תסנובת החלקיק LDL 500 מיקרוליטר ואת פתרון המיקרו-רנ"א-זרע-DMSO 1.5 מיליליטר, והדגירה במשך שעתיים ב-40 מעלות צלזיוס. בצע דיאליזה דומה כפי שתואר קודם לכן, ולאחסן את פתרון החלקיק LDL שכותרתו תחת אווירת גז אינרטי בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להתחיל, לדלל את פתרון חלקיקי HDL או LDL ב- PBS בין אחד ל-100 ואחד ל-1, 000. קליב נציץ על ידי לחיצה על סרט דבק נגד מצע נציץ, ומושך את הקלטת כדי להסיר את שכבות mica העליון. השתמש פיפטה להפקיד שני microliters על נציץ מחשוף טרי כדי דגירה במשך חמש דקות.
חלקיקי ליפופרוטאין נוטים ליצור קרום קשר מתמשך על משטחים. כתוצאה מכך, חשוב להתאים את ריכוז החלקיק על משטח נציץ כדי לקבל אלה בודדים. לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם עם PBS.
מלאו את התא הנוזלי המהיר AFM ב-PBS והרמו את הסורק נושא הנציה לשלב ה-AFM המהיר. בתוכנת הבקרה, התחל את תהליך הגישה של ה- cantilever למשטח הנציץ. השתמש בגדלי סריקה של פחות ממיקרומטר מרובע אחד, ושמור על כוחות ההדמיה נמוכים ככל האפשר.
תדמיין את הדוגמה במצב הקשה. לטעון את הנתונים לתוך Gwyddion, ולזהות את החלקיקים באמצעות גרגרי סימן על ידי פונקציית סף. התאימו את ערך סף הגובה כדי להסוות את החלקיקים הבודדים.
בדרך כלל, רמה סביב 50% היא נקודת התחלה טובה. הסירו רקע פולינומיאלי כדי לשטח את התמונה, והפעילו את האפשרות 'אל תכלול אזור מסיכה'. יצא את ערכי הגובה המרביים של החלקיקים שזוהו באמצעות התפלגות של פונקציית מאפייני תבואה שונים, וחזור על שלבים אלה עבור כל התמונות המוקלטות.
בניסוי זה, שחזור של חלקיקי HDL בוצע באמצעות delipidation של חלקיקי HDL, ואחריו relipidation ו דיאליזה. ניתן להשיג תשואה של 50% מחלקיקי HDL משוחזרים. עם זאת, אותו תיוג עם microRNA לא היה ריאלי עבור תיוג של חלקיקי LDL, בשל הידרופוביות של חלבון אפוליפופרוטאין B100.
לכן, DMSO שימש לחדירה של monolayer השומנים של חלקיקי LDL, עם תשואה קרובה ל 100% במהלך בקרת איכות, הדילול הוא קריטי לניתוח. התמונה העליונה מציגה צפיפות חלקיקים גבוהה מדי. התמונה התחתונה מתאימה לניתוח.
פונקציות צפיפות ההסתברות של גבהים חלקיקים חושבו להשוואה של התפלגות גודל של חלקיקי ליפופרוטאין מקוריים, מסומנים ומתויגים כבקרה. השינוי היחסי לפני ואחרי הליך התיוג ניתן להזנחה. בעת טיפול אוליגונוקלאוטידים RNA, לעבוד ללא RNAse.
השתמש מתכלים פלסטיק חד פעמי טרי, תמיד ללבוש כפפות. השתמש רק בפתרונות נטולי גרעין. AFM במהירות גבוהה היא רק שיטה אחת כדי לקבוע את הצורה הכללית של ליפופרוטאינים.
שיטה חלופית תהיה מיקרוסקופ אלקטרונים. ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים, ולעבוד ברדס אדים תוך טיפול אתר diethyl.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
