Biochemistry
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Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular
Chapters
Summary May 9th, 2019
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Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.
Transcript
Partículas de lipoproteína são veículos de transporte nativos. O enriquecimento de substâncias estrangeiras facilita seu uso como transportador de trilhos. A rotulagem específica de moléculas ou partículas inteiras torna viável medir a absorção celular.
Os dois métodos de enriquecimento são rápidos e fáceis de usar, e podem ser adaptados para uma ampla gama de substâncias. Demonstrando o procedimento estarão Markus Axmann e Andreas Karner, dois pós-doutores do meu laboratório. Para começar a delipidação em uma capa de fumaça, misture de um a dois mililitros de solução HDL preparada contendo cinco miligramas de partículas HDL com 50 mililitros de mistura pré-resfriada de três a dois de éter de etanol dietil em um tubo de centrifugação conical.
Incubar por duas horas a 20 graus Celsius negativos. Centrifugar a 2500 vezes g por 10 minutos a 10 graus Celsius negativos. Descarte o supernaspe, resuspenque a pelota em 50 mililitros de mistura de éter de etanol pré-resfriado e vórtice brevemente.
Incubar uma segunda vez por duas horas a 20 graus Celsius negativos. Centrifugar novamente a 2500 vezes g por 10 minutos a 10 graus negativos Celsius. Em seguida, insira tubos que forneçam fluxo de gás nitrogênio para secar a pelota.
E resuspensá-lo em 250 microliters de buffer A.Determine a concentração de proteína usando o ensaio de proteína bradford ou outro apropriado. É fundamental remover quaisquer remanescentes da mistura de éter de diethyl de etanol, pois esses solventes inibiriam a relicência de apolipoproteínas. Em seguida, diluir para uma concentração final de um miligrama de proteína por 250 microliters de buffer A.Insira uma tubulação que forneça gás inerte na parte da solução no tubo.
Se necessário, armazene a solução durante a noite a quatro graus Celsius sob a atmosfera de gás inerte. Para começar a reconstituição, em um tubo de vidro limpo, misture 100 microliters de CO, 13,5 microliters de C e 500 microliters de PC. Em seguida, gire o tubo de vidro enquanto lava o gás nitrogênio dentro do tubo para secar a mistura, a fim de produzir uma camada de superfície homogênea. Em um tubo de reação de 0,5 mililitro, prepare uma solução de espermatozoides fresca de 30 mililitros no buffer A.Em seguida, misture 100 microliters de microRNA sintético de 10 micromolar com 100 microlitres de solução de espermatozoides em um tubo de reação de dois mililitros.
E incubar por 30 minutos a 30 graus Celsius. Em seguida, transfira a solução incubada de 200 microliter para o tubo de vidro para reidratar a camada de superfície mastermix pc-CO-C preparada. E então adicione 50 microliters de uma solução de desoxicolato de sódio de 30 mililitros por mililitro.
Mexa a quatro graus Celsius por duas horas. Depois disso, adicione 250 microliters da solução HDL delipidada no tubo de vidro. E mexa a 4 graus Celsius durante a noite.
Para começar a diálise, adicione primeiro 50 gramas de contas adsorbentes a 800 mililitros de água dupla destilada. E use um agitador magnético para mexer por um minuto. Espere 15 minutos para as contas se acalmarem, e decantar o supernatante.
Repita o procedimento com PBS pré-resfriado. de diálise pré-molhados na PBS. Use uma seringa para adicionar a mistura previamente preparada nas fitas de acordo com as instruções do fabricante.
Adicione as contas adsorbentes tratadas com PBS a três litros de PBS, e coloque as fitas no PBS para dialisar a quatro graus Celsius. As contas mantêm o gradiente de densidade ao longo da membrana de diálise constante. Troque o tampão e as contas após uma hora e duas horas.
Após 24 horas, com uma seringa, extraia a solução do em um tubo de reação de 1,5 mililitro para recuperar a solução de partículas HDL reconstituída. Determine a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford. Forneça gás inerte ao tubo de reação, selá-lo e armazenar a solução de partículas HDL reconstituída sob atmosfera de gás inerte a quatro graus Celsius.
Primeiro, prepare uma solução fresca de espermatozoides de 30 milimilitos em água sem RNAse. Misture 100 microlitres de 10 micromolar de microRNA sintético com 100 microliters de solução de esperma em um tubo de reação de dois mililitros. E incubar por 30 minutos a 30 graus Celsius.
Em seguida, adicione 100 microliters de DMSO e 1,2 mililitros de tampão LDL 1X à solução de espermatozoides microRNA preparada. Diluir a solução de partículas LDL previamente preparada com PBS até uma concentração final de aproximadamente quatro miligramas por mililitro. Em seguida, desenhe 450 microliters da solução diluída em um tubo de reação de 1,5 mililitros e misture com 50 microliters de tampão LDL 10X.
Incuba-lo por 10 minutos no gelo. Após a incubação, combine a solução de partículas LDL de 500 microliter e a solução microRNA-spermine-DMSO de 1,5 mililitro, e incuba-a por duas horas a 40 graus Celsius. Realize diálise semelhante à descrita anteriormente, e armazene a solução de partículas LDL rotulada sob atmosfera de gás inerte a quatro graus Celsius.
Para começar, diluir a solução de partículas HDL ou LDL em PBS entre um a 100 e um para 1.000. Aperte mica pressionando fita adesiva contra o substrato mica e puxando a fita para remover as camadas de mica superior. Use uma pipeta para depositar dois microliters em mica recém-cortada para incubar por cinco minutos.
Partículas de lipoproteína tendem a formar membranas contínuas de ligação nas superfícies. Consequentemente, é importante ajustar a concentração de partículas na superfície mica para obter as individuais. Após a incubação, enxágue a amostra com PBS.
Encha a célula líquida AFM de alta velocidade com PBS e monte o scanner de transporte de mica para o estágio AFM de alta velocidade. No software de controle, inicie o processo de aproximação do cantilever para a superfície mica. Use tamanhos de varredura inferiores a um micrômetro quadrado, e mantenha as forças de imagem o mais baixas possível.
Imagem da amostra no modo de toque. Carregue os dados no Gwyddion e detecte as partículas através da marca de grãos por função limiar. Ajuste o valor do limiar de altura para mascarar as partículas individuais.
Normalmente, um nível em torno de 50% é um bom ponto de partida. Remova o fundo polinomial para achatar a imagem e ative a opção excluir região mascarada. Exporte os valores máximos de altura das partículas detectadas utilizando a distribuição de várias características do grão e repita estas etapas para todas as imagens gravadas.
Neste experimento, a reconstituição de partículas HDL foi realizada através da delipidação de partículas HDL, seguida de relicação e diálise. Um rendimento de 50% das partículas DE HDL reconstituídas pode ser alcançado. No entanto, a mesma rotulagem com microRNA não foi viável para a rotulagem de partículas LDL, devido à hidroofobidade da proteína apolipoproteína B100.
Assim, o DMSO foi utilizado para a penetração da monocameira lipídica das partículas LDL, com rendimento próximo a 100% Durante o controle de qualidade, a diluição é fundamental para análise. A imagem superior mostra uma densidade de partículas muito alta. A imagem inferior é adequada para análise.
As funções de densidade de probabilidades das alturas das partículas foram calculadas para comparação das distribuições de tamanho das partículas nativas, rotuladas e rotuladas de lipoproteínas de controle. A alteração relativa antes e depois do procedimento de rotulagem é negligente. Ao manusear oligonucleotídeos de RNA, trabalhe livre de RNAse.
Use materiais descartáveis frescos e use sempre luvas. Use apenas soluções sem nuclease. AfM de alta velocidade é apenas um método para determinar a forma geral das lipoproteínas.
Um método alternativo seria a microscopia eletrônica. Use equipamentos de proteção pessoal adequados e trabalhe em um capô de fumaça enquanto manuseia éter dietil.
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