Kartlegging av emergent romlig organisering av pattedyrceller bruker Micropatterns og kvantitativ Imaging

Denne metoden gjør det mulig å manipulere og kvantifisere hvordan cellene organiserer kollektivt. Dette er viktig fordi vi kan modellere mønster i in vitro og disentangle signaler tett skrevet in vivo. Teknikken krever minimalt spesialutstyr, slik at det kan etableres i et standard biologilaboratorium, og det er kvantitativt, noe som gjør det mulig å finne sub-visuelle mønsterhendelser.

Denne metoden kan enkelt brukes på et hvilket som helst cellesystem der mønster kan dukke opp og oppdage ikke-tilfeldige mønstre av differensiering, spredning og celle-til-celle konkurranse. Hovedtrekket med denne metoden er systematisk optimalisering av mikropatteringsparametere for nye celletyper. Mønsterstørrelse og -form, matrisetype og celle vedheftstid er for eksempel mønsterstørrelse og -form.

Bruk hansker, legg et stykke laboratoriefilm i bunnen av en 10-centimeter firkantet petriskål. Bruk et hullslag på 12 millimeter til å kutte hydrofobe plastsklier for å lage 12 millimeter-rundt dekselslips, og legg dekselslipper i en ny petriskål. Bruk pinsett til å fjerne beskyttelsesfilmen forsiktig fra dekselslippene.

Plasser fotomasken på en ren og stabil overflate, krom side opp, og legg til en to-mikroliter dråpe dobbeltdestillert vann i posisjonen til ønsket chip design. Trykk forsiktig på et deksel som glir på dråpen og plasser holderen på toppen av plastskliene. Fest forsiktig denne sandwichen med klemmer for å opprettholde plastbitene i kontakt med fotomasken.

Plasser enheten i en ultrafiolett ozonlampe omtrent to centimeter fra lyskilden i en 10-minutters belysning. På slutten av belysningsperioden, ta tak i smørbrødet med fotomasken nederst og fjern forsiktig klemmene samtidig som du opprettholder trykket med den ene hånden for å hindre at lysbildene beveger seg rundt mens de demonterer smørbrødet. Når alle klemmene er fjernet, fjerner du holderen, pass på at alle plastbitene fortsatt er på masken og ikke sitter fast på holderen, og legger dobbeltdestillert vann til sponene for å forsiktig løsne sponene fra fotomasken.

Plasser de fotomønstrede sjetongene i matrisedeponeringskammeret, opplyst side opp, og legg til 200 mikroliter beleggoppløsning på hver brikke. Deretter legger du til en tre centimeter petriskål fylt med dobbeltdestillert vann til kammeret for å begrense fordampning ved fire grader Celsius over natten. For såing av embryonale celler på sjetongene, vask potetgullene med to minst fem minutters vasker i friske, sterile PBS per vask, før du dispenserer en gang ti til de femte cellene i 200 mikroliter av riktig cellekulturmedium på hver chip.

Lukk deretter såingskammeret. Inkuber i en time for å la cellene holde seg til sjetongene. Når cellene har festet, fyll brønnene på en multibrønnplate med 500 mikroliter varmt medium per brønn, og bruk sterile pinsett for å overføre chips til individuelle platebrønner.

Rist platen kraftig for å løsne eventuelle ikke-tiltalende celler, og skift umiddelbart supernatanten med friskt, varmt medium. Kontroller deretter under mikroskopet for å observere om mønsteret er synlig. 48 timer etter deres plating, bør cellene danne tette kolonier som følger nøye formen på mønstrene.

La sjetongene i platen, fjern alt, men akkurat nok medium for å hindre at sponene tørker, og legger til minst 500 mikroliter paraformaldehyd eller PFA-basert fikseringsløsning per brønn. Etter ti minutter, vask brønnene kort tre ganger med vaskeløsning, etterfulgt av en vask med 50-millimolar ammoniumklorid fortynnet i vaskeløsning for å slukke gjenværende PFA crosslinking aktivitet. Etter siste vask, behandle prøvene med blokkeringsløsning i minst 30 minutter.

For immunstaining av chip kulturer, overføre chips til en farging kammer celle side opp, og umiddelbart legge til 100 mikroliter av den primære antistoffløsning av interesse for hver chip. Etter en time på en roterende plattform ved romtemperatur, vask potetgullene tre ganger med vaskeløsning som demonstrert, og inkubere sponene med de riktige sekundære antistoffene i en time på den roterende plattformen. På slutten av den sekundære antistoffinkubasjonen vasker du sponene tre ganger i vaskeløsning og monterer brikken på et mikroskopisklie med 20 mikroliter av et hvilket som helst standard monteringsmedium.

Hvis du vil se for deg sjetongene, må du først justere skannehastigheten, bildeoppløsningen, rammesnittet og detektorgevinsten for å identifisere en optimal mellom bildekvaliteten og bildetiden. Deretter skaffe bilder av hver chip. Når alle bildene er anskaffet, installerer og kjører DupCells etter dokumentasjonen som er tilgjengelig på nettet, oppretter et nytt eksperiment og importerer bildene til programmet.

Bruk Nessys-modulen til å segmentere kjernene basert på atomkonvoluttsignalet. Bruk den grunnleggende segmenteringsmodulen til å identifisere mønsterets autofluorescence-signal. Klikk deretter Fullfør”og vent til alle bildene skal behandles.

Hvis du vil opprette kjerneobjekter og beregne grunnleggende objektfunksjoner, starter du modulen Intrinsic Features fra oppgavelinjen og lukker Ellipsoid Montør- og Surface Extractor-panelene for å holde panelet Grunnleggende funksjoner åpne. Velg kjernen”som objekttype, og velg det angitte prefikset som er gitt for de segmenterte bildene. Klikk deretter på Compute”, og vent til alle bildene skal behandles.

På dette stadiet må flere funksjoner skrives inn i kjerner før du eksporterer dataene for vår analyse. Hvis du for eksempel vil lagre navnet på bildet hver kjerne tilhører som et Nucleus-attributt, klikker du Data”og Nytt attributt”og velger kjerne”i popup-dialogen. Klikk OK”velg Samle inn data fra andre objekter som er koblet til noden”, og klikk neste”I venstre panel, velg Bilde”og dobbeltklikk på avhørsmerket for å angi bildenoden som mål for banen.

Utvid Reduksjonsoperasjon-ruten, og velg Hent en”Utvid ruten Tilgjengelig attributt og velg Navn-attributtet. Klikk deretter Endre”og Neste”Skriv inn bildenavn, trykk tab-tasten, og klikk Fullfør”Eksporter deretter dataene til en tabulatordelt verdifil. For vår analyse kan du sløyfe de eksporterte dataene til datamappen i R-Script-mappen.

Åpne Vårt Studio”og åpne binned kartmalen R-Script”Sett deretter arbeidsmappen til kildefilplasseringen, og kjør skriptet for å generere tetthetskart. På en time etter cellesåing kan den enkelte cellekulturen klappe ikke være helt samløpet som cellene sprer seg over tid. Mønstrene vil imidlertid bli fullstendig kolonisert med bare svært få celler utenfor klebende overflater.

Mønster som ikke er klart opptil to timer etter såing indikerer en feil i prosedyren. Den romlige innesperringen av mus embryonale stamceller på store disker eller ringmikromønstre styrer mønsteret av en underpopulasjon av celler som uttrykker den mesodermale brachyury markøren. For eksempel, når musen embryonale stamceller dyrkes på store mikromønstre, er brachyury-positive celler fortrinnsvis begrenset til periferien av mønsteret der den lokale celletettheten er den laveste.

Dette mønsteret er bekreftet av kartet over hjerne-brachyury intensitet. Disse dataene viser at metoden kan avsløre subvisuell informasjon som inspeksjon av en koloni er ikke tilstrekkelig til å identifisere noen form for romlig organisasjon i markør for interesseuttrykk. Dette forklares spesielt av den viktige koloni-til-kolonivariabiliteten.

Teknikken viser også at det ikke finnes noe påviselig mønster for hemmer av DNA-bindende som kan tyde på at T-mønster ikke drives av beinmorfogenetisk proteinsignalering i denne sammenhengen. Husk alltid hvilken side av dekselet slip har eliminert og belagt, og også være sikker på at cellene har riktig festet før vasking av overflødige celler. Denne metoden gjør det mulig å studere miljøsignalene som er viktige for å veilede selvorgan organisering av celler, og kan også informere matematiske modeller som hjelper oss bedre under rudimental mønster.