Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Användning av ryggradslösa Galleria mellonella som en infektions modell för att studera den Mycobacterium tuberkulos Complex
Summary June 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Galleria mellonella etablerades nyligen som en reproducerbar, billig och etiskt godtagbar infektions modell för mykobakteriets tuberkuloskomplex . Här beskriver vi och demonstrerar de åtgärder som vidtagits för att etablera en framgångs rik infektion av G. mellonella med bioluminiscerande Mycobacterium bovis BCG Lux.
Transcript
Detta protokoll beskriver användningen av Galleria mellonella som en alternativ infektionsmodell för att studera tuberkulos, vilket minskar antalet däggdjursmodeller som används i forskningen. Jämfört med konventionella däggdjursmodeller som möss är Galleria mellonella en billigare, etiskt acceptabel och mer tillgänglig modell för att studera tuberkulos. Ytterligare optimering av denna modell kommer att möjliggöra screening av kandidat antimycobacterial läkemedelseffekt och toxicitet och kommer att bidra till utvecklingen av akut behov av nya therapeutics för tuberkulos.
Galleria mellonella har ett komplext medfött immunsystem jämförbart med däggdjurens. Studien av värd-patogen interaktion kan ytterligare avslöja rollen av medfödda immunitet i tuberkulos. Användningen av Galleria mellonella som infektionsmodell är inte begränsad till tuberkulos och har använts i stor utsträckning för andra bakterie- och svamppatogener under det senaste decenniet.
Till att börja med, avfrostning en frusen 1,2-milliliter glycerol lager av Mycobacterium bovis BCG lux, Montreal vaccin stam omvandlas med skytteln plasmid pSMT1 bär luxAB gener. I en märkt 250-milliliter Erlenmeyerkolv, inokulera 15 milliliter av Middlebrook 7H9 buljong med en avfrostad 1,2-milliliter alikvot av BCG lux. Placera kolven i en förseglad behållare för biosäkerhet och inkubera vid 37 grader Celsius i en orbital shaker inkubator på 220 rpm i 72 timmar.
Efter inkubation, förbered 1:10 utspädningar av kulturen i fosfatbuffrad koksaltlösning i luminometerrör, virvel, och ladda luminometerrören i luminometern. Ladda substratet 1%n-decylaldehyd i absolut etanol i injektorplattformen och mät bioluminescensen. Konvertera bioluminescensen till kolonibildande enheter för att kontrollera tillväxten av BCG lux-kultur.
Överför kulturen till ett centrifugrör och centrifug vid 2, 175 gånger g i 10 minuter vid rumstemperatur till pelletcellerna. Kassera supernatanten i ett lämpligt desinfektionsmedel med känd mykobaktericidaktivitet. Tvätta cellpelleten två gånger i 50 milliliter PBS-T genom centrifugering vid 2, 175 gånger g i 10 minuter för att förhindra bakterieklumpning.
Efter den slutliga tvätten, dekantera avfallet supernatant och resuspend den mykobakteriella cell pelleten i den erforderliga volymen av PBS-T för att späda ut mykobakteriell suspension till önskad celltäthet. Förbered sedan 10-faldig serieutspädningar av inokulat i 24-brunnsplattor med hjälp av PBS-T. Platta ut 10 mikroliter av varje utspädning på Middlebrook 7H11 agar plattor i två exemplar för att räkna upp inokulat CFU räknas.
Underhåll de köpta instar larverna i mörker vid 18 grader Celsius vid ankomsten och använd inom en vecka efter köpet. Identifiera och välja friska larver för experimentering baserat på enhetlig krämfärg, lämplig storlek och vikt, hög motilitet och som har förmågan att rätta sig själva när de vänds. Med hjälp av trubbiga pincett, noggrant räkna de friska larverna i en Petri-maträtt fodrad med ett lager av filterpapper och förvara i rumstemperatur i mörkret tills användning.
Förbered injektionsplattformen genom att tejpa ett 94-millimeters diameter cirkulärt filterpapper på en plan, upphöjd yta. Aspirera tre volymer av 70%etanol i en 25-mikroliter mikrosyring för att sterilisera, kassera och ytterligare skölja med tre volymer av steril PBS-T. Sedan, återanvända den beredda BCG lux inokulat och aspirera 10 mikroliter i den steriliserade microsyringe.
Använd en separat spruta för att aspirera PBS-T för en negativ kontroll. Efter 10 injektioner, resuspend bcg lux inokulat för att säkerställa enhetlig cell suspension. Använd pincett för att plocka upp en larv och placera på injektionsplattformen.
På plattformen, vänd larven på ryggen och immobilisera genom att säkra huvud och svans med pincett. Lokalisera den sista vänstra prolegen, räkna ner från larvens huvud och sätt försiktigt in nålens spets fem till sex millimeter djupt i 10 till 20 graders vinkel mot det horisontella planet. Injicera inokulat från sprutan.
Efter varje infektion överför du den infekterade larven till en Petri-rätt fodrad med ett lager av filterpapper. En enda 94-millimeters Petriskål rymmer upp till 30 larver. Förvara petriskålen i en ventilerad, mörk låda inuti en inkubator vid 37 grader Celsius med 5%-koldioxid.
Övervaka larvernas överlevnad varje dygn. Larver anses döda när de misslyckas med att flytta som svar på beröring. Registrera överlevnaden och bedöm statistisk signifikans med Mantel-Cox-testet.
Varje 24 timmar väljer slumpmässigt fem infekterade larver och använd en bomullspinne som är indränkt i 70%etanol för att försiktigt sterilisera larvytorna. Placera larverna individuellt i två milliliter lysningsmatrisrör som innehåller 800 mikroliter av steril PBS. Använd sedan en homogenisator för att homogenisera larverna i 60 sekunder vid sex meter per sekund.
Centrifugera lysningsrören vid 3, 500 gånger g i fem sekunder för att avlägsna homogenatet från locken och försiktigt dekantera homogenatet i fem sterila luminometerrör var för sig. Reservera 100 mikroliter homogenat i ett sterilt 1,5-milliliter reaktionsrör. Återvinn eventuell återstående homogenat genom att tvätta lysningsmatrisrören med en milliliter PBS-T och pipetten i motsvarande luminometerrör.
Vortexa luminometerrören och mät homogenaternas bioluminescens på en luminometer. Förbered sedan 10-faldiga serieutspädningar av de reserverade 100 mikrolitererna av homogenate i 24-brunnskulturplattor med hjälp av PBS-T. Pipett 10 mikroliter av utspädningen på varje Middlebrook 7H11 agar platta och använda en steril platta spridare att sprida.
Inkubera vid 37 grader Celsius i två veckor. Efter det, räkna kolonibildande enheter. Bestäm RLU till CFU förhållandet av BCG lux efter in vivo infektion.
I detta experiment observerades BCG lux dosberoende virulens i G.mellonella larver under en 96-timmars inkubationstid. Den dödliga dos som krävs för 50%larval dödlighet bestämdes vara en gånger 10 till kraften av sju CFU. Kontrollgrupper som injicerats med en 10-mikroliterdos pbs-T eller de som helt enkelt prickade simulerande nålskador påverkade inte larvhälsan eller ledde till en ökad dödlighet.
För larver infekterade med de två gångerna 10 till kraften i sju CFU dos av BCG lux, melanization av larval dorsala linjen observerades från 48 timmar post infektion och systemiska melanization observerades från 96 timmar post infektion. Infektion med en en gånger 10 till kraften i sju CFU dos av BCG lux resulterade i en första nedgång av bioluminescens inom de första 72 timmar efter infektion. Men efter 72 timmar post infektion, bioluminescens av BCG lux började platå, som anger inrättandet av långlivade infektion.
I detta särskilda infektionssystem varierade in vivo-förhållandet mellan RLU och CFU från 2:1 till 5:1 med ett genomsnitt på 4:1 under 168-timmars tidsföringen. Under injektionen, kom ihåg att säkra larverna så att risken för överpentning minimeras. Oavsiktlig punktering av tarmen kan leda till ökad dödlighet.
Genom att utföra histopatologisk analys kan introduktion av mykobakterier med värdcellerna visualiseras. Ytterligare transkriptomisk analys kan avslöja interaktionen på genomisk nivå. Användningen av denna infektionsmodell kan möjliggöra snabbtestning av nya läkemedelskandidater i ett tidigt utvecklingsskede, vilket avsevärt minskar antalet djur som används vid läkemedelsscreening.
Denna infektionsmodell kräver användning av en spruta, som kan associeras med nålsticksskada. Vi rekommenderar användning av vår injektionsteknik för att minimera sådan risk.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE