Afstemmings degradatie om een specifieke en efficiënte eiwit depletie te bereiken

Een veel voorkomende techniek om erachter te komen van de functie van een eiwit is om het te verwijderen en te zien wat er gebeurt. Maar dat kun je niet doen met een essentieel eiwit. Het is essentieel, de cel sterft.

Dus je hebt een manier nodig om dat eiwit te verwijderen en een glimp op te vangen van wat er gebeurt net voor de celdood. Eiwituitputting moet snel zijn, dus je krijgt geen secundaire effecten. Het moet specifiek zijn, zodat alleen dat eiwit wordt verwijderd en alleen uitgeput wanneer u dat wilt.

En het mag geen invloed hebben op de cel op een andere manier dan het verwijderen van dat eiwit. Na de voorbereiding van de stam, gebruik maken van een nachtelijke cultuur om te bepalen welke verdunning nodig is. Gebruik deze informatie om een voldoende nieuwe cultuur op te zetten met een OD600 tussen 0,1 en 0,2 en te laten groeien bij 30 graden Celsius.

Voeg in een rookkap een methanol van 30 tot 50% van het beoogde monstervolume toe aan een buis van 15 milliliter. Sluit de buizen goed, label ze en leg ze op droogijs om te koelen. Vervolgens label 1,5 milliliter buizen voor langdurige opslag van de monsters en plaats op ijs om af te koelen.

Koel ten minste een milliliter water per monster op ijs. Zodra de doeloptische dichtheid voor het begin van de pre-incubatie is bereikt, breng een monster over in de vooraf voorbereide buis met koude methanol. Keer de buis kort om en plaats hem terug op droog ijs.

Dit is het niet-geïnduceerde controlemonster. Voeg onmiddellijk de bèta-estradiol toe, zodat de uiteindelijke concentratie 10-micromolar is. Draai krachtig om te mengen.

Blijf de cultuur groeien zoals voorheen, uitbroeden met bèta-estradiol voor de optimale tijd zoals beschreven in het tekstprotocol. De bèta-estradiol incubatietijd is de belangrijkste stap, en moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit. Te kort en de uitputting is onvolledig en traag.

Te lang en het eiwitgehalte zal dalen nog voordat je de auxine hebt toegevoegd. Pipette up 0,5 microliter van IAA per milliliter cultuur om later toe te voegen. Verzamel een monster uit de onvertonde cultuur zoals eerder beschreven.

Voeg onmiddellijk de IAA toe aan een laatste concentratie van 750 micromolar en wervel krachtig om te mengen. Start een timer zo snel mogelijk na het mengen. Verzamel monsters volgens het experimentele ontwerp.

Leg vervolgens de monsters op ijs. Zorg ervoor dat geen van de monsters bevroren is. Indien van toepassing hebben, zachtjes warm ze in de hand, terwijl voortdurend omkeren.

Zodra alle monsters zijn verzameld en niet bevroren, centrifugeren ze op 3, 500 keer G en vier graden Celsius gedurende twee minuten. Giet de methanol en medium mix en plaats de monsters terug op ijs. Dan, resuspend de cel pellet in een milliliter water en breng deze schorsing naar een gelabelde buis op ijs.

Centrifuge kort met een snelheid van meer dan 15.000 keer G om de cellen af te weren. Plaats hierna de buizen terug op ijs en aspiraat van de vloeistof. In deze studie wordt degradatie afgestemd op het bereiken van specifieke en efficiënte eiwituitputting zonder anders het metabolisme van de gistcel te beïnvloeden.

De low-overvloed spliceosomal Prp2 en Prp22 eiwitten zijn beide uitgeput tot minder dan 20%na 20 minuten pre-incubatie met beta-estradiol, gevolgd door 15 minuten met auxine. Langere pre-incubatietijden leiden tot snellere uitputting, maar vertonen ook ongewenste eiwituitputting vóór auxine toevoeging. Ter vergelijking, de meer overvloedige Dcp1 is slechts uitgeput tot ongeveer 30%met dezelfde behandeling.

Echter, 60 minuten pre-incubatietijd resulteert in uitputting tot 13%met dezelfde auxine behandeling ten koste van uitputting voordat de auxine wordt toegevoegd. Optimaliseer de pre-incubatietijd en verlies de tijd tussen uw tijdspunten niet uit het oog. Wat te doen volgt op uw vraag.

We hebben ontdekt dat 10-mils monster van cultuur genoeg is voor eiwit, DNA, of RNA analyse. De bemonsteringsprocedure is ook gemakkelijk aan te passen voor ChIP. Nu is er een snelle en specifieke manier om eiwitten uit te putten.

Zo kan de functie zelfs van essentiële proteïnen worden gevonden. Het protocol is redelijk veilig. Methanol is de enige gevaarlijke chemische stof.

Zorg tijdens het uitdelen. Doe het in een rookkap, en draag twee paar handschoenen, als methanol kan krijgen door de meeste nitril handschoenen.