Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Core/Shell trykning stilladser til vævs konstruktion af rørformede konstruktioner
Summary September 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Præsenteret her er en enkel at bruge, kerne/shell, tredimensionel bioprinting set-up for One-Step fabrikation af hule stilladser, egnet til vævs konstruktion af vaskulære og andre rørformede strukturer.
Transcript
Fremstillingen af rørformede strukturer er en lovende tilgang til vævsteknik af vaskulære netværk, som fortsat er en af de største udfordringer i dyrkning af tykt væv in vitro. Den største fordel ved kernen / shell teknik er den enkle produktion af hule filament stilladser i et enkelt trin, hvilket reducerer fabrikationstiden og potentielt tillader direkte udskrivning med celler. Forberedelse af en hydrogelformulering med de relevante viskoelastiske egenskaber og opretholdelse af en kontinuerlig afbalanceret strøm af kerne-/skalmaterialerne er afgørende for 3D-print af stabile stilladser.
Til at begynde, fyldes den sterile 5 ml sprøjte med frisklavet hydrogel. Fyld en anden 5 ml sprøjte, udstyret med en 27 gauge stump-end nål, med frisklavet crosslinking opløsning. Monter kerne-/skaldysen.
Sæt en G27 stump-end nål som kernekomponenten og fastgør nålen ved hjælp af skruen. Den indvendige nål skal stikke ca. 1 mm ud fra den ydre kerneskaldyse. Tilslut sprøjten med krydslinkopløsningen til G27-nålen i dysen, og læg sprøjten i en af ekstruderbeslagene på en ethanolsteriliseret 3D-printer.
Monter sprøjten med hydrogel i den anden ekstruder og tilslut den til dysen. Brug en Luer-lås til at forbinde et kort rør til siden Luer-indgangen i kerne-/skaldysen. Juster forsigtigt justeringen manuelt, indtil dysen rører overfladen, før dysen trækkes tilbage til en afstand svarende til den ydre dysediameter.
Importer den genererede stillads-g-kode, og tryk på Afspil for at starte udskrivningsprocessen. Efter udskrivning fjernes underlaget forsigtigt med det udskrevne stillads, og den sekundære krydslinkingsopløsning hældes over hele stilladset. Stilladset inkuberes i et minut ved stuetemperatur.
For at tage stilladset af underlaget skal du forsigtigt trække stilladset sidelæns. Hvis stilladset klæber kraftigt til underlaget, skal du indsætte en skarp kant mellem de to materialer for at adskille dem. Overfør stilladset til en frisk beholder.
UV steriliserer begge sider af stilladset i 30 minutter på hver side. Placer derefter stilladset i et farveløst cellekulturmedium og inkuber stilladset ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid i mindst 24 timer. Den næste dag, høst huvex fra en in-vitro kultur med 0,25% trypsin i fem minutter ved 37 grader Celsius.
Når cellerne er taget af, skal du stoppe den enzymatiske reaktion med 3 ml frisk cellekulturmedium og indsamle cellerne ved centrifugering. Pelleten suspenderes igen i frisk kulturmedium indeholdende fenolrød, og cellerne fortyndes til en 3,4 gange 10 til den femte endotelceller pr. milliliterkoncentration. Indbevar cellerne i en steril 5 ml sprøjte udstyret med en 27 gauge nål og find et indgangspunkt i stilladset.
Justering af nålen med den lige del af stilladset glødetråd, forsigtigt punktere stilladset i en lav vinkel. Bekræft, at nålen er inden for kanalens hule glødetråd, og tryk forsigtigt stemplet for at indsprøjte ca. 1-2 ml celleaffjedring i stilladset. Affjedringens flow skal være synlig gennem det gennemsigtige stillads.
Når hele stilladset er fyldt med celleaffjedring, nedsænkes stilladset i frisk cellekulturmedium, og stilladset returneres til cellekulturskuvøsen i op til 10 dage. Ved levende/død billeddannelse ved inkubationens afslutning skylles stilladset med PBS, og der skal anvendes en stump nål til omhyggeligt at indsprøjte levende/død opløsning i stilladset. Bekræft, at opløsningen har fyldt hele stilladset, og placer stilladset ved 37 grader Celsius i 30 minutter.
Ved slutningen af inkubationen skylles stilladset med PBS, og stilladset overføres forsigtigt til et glasrutsjebane. De farvede celler kan derefter observeres i stilladserne under et fluorescensmikroskop. I dette tværsnit af et frisktrykt og postforarbejdet stillads kan der observeres en klart synlig hul kanal i glødetråden.
Selv efter 72 timers inkubation i cellekultur medium ved 37 grader Celsius som påvist, filamentet bevarer den hule struktur i hele stilladset længde. Her vises en repræsentativ levende/død analyse af endotelceller efter 48 timers kultur i et stillads. De levende celler kan identificeres ved deres lyse grønne fluorescerende signal.
Denne teknik er grundlaget for et-trins fabrikation af hule rørformede stilladser og kan opgraderes ved direkte udskrivning ved hjælp af celler indarbejdet i bio-blæk.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE