Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Lentiviral CRISPR/Cas9-medierad genom redigering för studiet av hematopoietiska celler i sjukdomsmodeller
Chapters
Summary October 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Beskrivna är protokoll för mycket effektiv genom redigering av murina hematopoietiska Stem och stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 systemet för att snabbt utveckla musmodell system med hematopoietiska systemspecifika genmodifieringar.
Transcript
Vi har utvecklat en effektiv och ekonomisk metod för att etablera möss med genmanipulation specifikt i hematopoetiska stamceller, Med hjälp av genomredigeringsteknik och lentivirusmedierade transgena leveranssystem. Fördelen med detta protokoll är att vi kan skapa djurmodeller hysa specifika mutationer i hematopoitiska celler på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt jämfört med konventionella mustransgena metoder. Demonstrerar proceduren blir Ying Wang, en forskare från mitt laboratorium.
För att generera lentiviruspartiklar, börja med att koda en sex brunnsplatta med kollagenlösning och inkubera den i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 30 minuter. Sedan, frö 293T celler på plattan och inkubera den i ytterligare två timmar. Under tiden förbereda blandningen av tre transfection plasmider genom att kombinera 0,9 mikrogram lentivirus vektor, 0,6 mikrogram psPAX2 och 0,3 mikrogram pMD2.
G och avjoniseras till 10 mikroliter per brunn. Tillsätt sedan försiktigt 50 mikroliter av 1X PBS och fem mikroliter av utspädd PEI MAX till plasmidblandningen, och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 15 minuter. Efter inkubationen, tillsätt en milliliter av DMEM.
Aspirera media från sex brunnsplattan och tillsätt en milliliter av plasmid blandning till varje brunn. Inkubera plattan i ytterligare tre timmar. Byt ut media med färsk DMEM och inkubera i 24 timmar.
Tillsätt en milliliter färsk DMEM och inkubera ytterligare 24 timmar. Efter total inkubation på 48 timmar, överför supernatanten till ett 50 milliliterrör och centrifugerar det vid 3000 gånger G i 15 minuter för att avlägsna eventuella fritt flytande celler. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 mikrometerfilter och ultra-centrifug det i tre timmar.
Aspirera försiktigt supernatanten och lämnar kvar den vita pelleten. Åter upphäva pelleten med 100 mikroliter av serumfria hematopoetiska cell expansionsmedium utan aeration. Håll en 10 microliter alikvot för att mäta viral titer och lagra resten av suspensionen på minus 80 Celsius tills den är klar att använda.
Efter att ha isolerat benen, placera dem i en 50 milliliter koniska röret med RPMI och placera röret på is. I ett biosäkerhetsskåp överför du benen till en steril 100-millimeterskulturskål. Sedan greppa ett ben med trubbiga tlysnor, och använd dissekering sax för att noggrant skära båda epifyser.
Fyll en 10 milliliter spruta med iskall RPMI och använd en 22 gauge nål för att spola benmärgen från skaftet i en ny 100 millimeter kultur skålen. Efter allt benmärgen har samlats in, gör en enda cell suspension genom att passera benmärgen genom en 10 milliliter spruta med en 18 gauge nål. Filtrera cellupphängningen genom en 70 mikrometercellsil i ett koniskt rör på 50 milliliter.
Därefter centrifugera röret enligt manuskriptriktningarna och aspirera supernatanten. Åter upphäva cell pellets i en lämplig volym av optimerad separation buffert. För att isolera härstamning negativa celler, använd en härstamning cell utarmning kit enligt tillverkarens instruktioner.
Re-suspend de isolerade härstamning negativa celler i serum-fri hematopoietic cell expansionsmedium. Förinkubera cellerna i 37 grader celsius i 5%koldioxid i två timmar. Lägg sedan till lentivirus enligt manuskriptriktningarna och lämna cellerna i inkubatorn i ytterligare 16 till 20 timmar.
Nästa dag, samla in lentivirus-transduced celler i en 15 milliliter koniska röret och centrifug dem på 300 gånger G i 10 minuter. Enligt NHA:s riktlinjer är det viktigt att hantera lentivirusvektorer på Reece Group nivå två. Försiktighetsåtgärder måste vidtas, baserat på facilitetsbestämmelser.
Aspirera försiktigt supernatanten och åter upphäva pelleten i 200 mikroliter av RPMI per mus. Håll cellerna i rumstemperatur tills transplantation till möss. Efter den andra bestrålning session, retro-orbitally injicera transduced delineage negativa celler i varje sövda musen med hjälp av en insulin spruta.
Tre till fyra veckor efter benmärgstransplantation, erhålla blodprov från retro-orbital vein med hjälp av kapillär rör. Överför 20 mikroliter blod i runda-botten polystyren provrör och placera på is. Efter RBC-lys, inkubera cellerna med en cocktail av monoklonala antikroppar i mörker i 20 minuter vid rumstemperatur.
Efter inkubation, tvätta, fixera och centrifugera cellerna och åter upphäva cellpelletsen i 400 mikroliter FACS-buffert. Håll proverna på fyra grader Celsius tills analys genom flödescytometri. Framgång av härstamning negativ celltransduktion kan utvärderas med flöde cytometrisk detektion av RFP.
Det har visats att efter sju dagar av in vitro-kultur, i genomsnitt, 75,7% av celler transduced. Flödescytometri har också använts för att analysera mus perifert blod efter rekonstitution med transduced och icke-transduced hematopoietic stamceller. I genomsnitt 94,8%av neutrofiler, 93,5%av monocyter, och 82,7%av B-celler uttrycker RFP.
Genomiskt DNA från de RFP-positiva blodkropparna har pcr amplifierats och sub-klonats för sekvensanalys. Olika mutationer upptäcks och 69%av klonerna visar ur ramen eller för tidigt stoppa mutationer. För att lyckas med detta förfarande krävs beredning av höga antiviruslager och optimerade villkor för transduktion och transplantation av hematopoetiska celler.
Vi har tillämpat denna teknik för att studera lagen om i hjärt-kärlsjukdom. Men det är också användbart att studera blodsjukdomar malignitet. Denna metod gör det möjligt för oss att studera funktioner av nya typer av gener i hematopoietiska systemet på hög effektivt och högt sätt.
Vi samlar detta över tillgängligheten av transgena möss.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
