Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Este protocolo le permite generar un gran número de células T funcionales específicas del antígeno que son un enfoque seguro deseado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. La principal ventaja de esta técnica es que le proporciona un proceso de transducción altamente eficiente y un gran número de células T funcionales. Esta técnica se puede ampliar para tratar la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes en las que se conocen los antígenos.

Además, los células T CAR pueden ser un tratamiento prometedor para ciertos tipos de cáncer. Este método se puede utilizar para generar células inmunitarias que expresen otros CAR. Es importante tener una buena técnica aceptada, leer todo el protocolo y planificar todo el experimento con antelación.

Este protocolo de dos semanas de duración incluye mini-pasos y el éxito depende del rendimiento adecuado de cada paso. Las demostraciones visuales de este método son fundamentales para que los alumnos las sigan correctamente. Prepare las células Phoenix para la transfección como se describe en el manuscrito.

Es una buena práctica marcar la pared lateral donde se agregará y eliminará el medio para minimizar el soplado de las células. En el día cero aspirar el sobrenadante de las células y lavarlos con cinco mililitros de PBS. Agregue cuidadosamente siete mililitros de medio sérico reducido a la pared lateral de la placa y transfiera las células de vuelta a la incubadora.

Añadir 1,5 mililitros de medio sérico reducido a dos tubos de polipropileno de fondo redondo de 14 milímetros. Añadir 40 micrómetros de reactivo de transfección a uno de los tubos y 15 microgramos de anticuerpos redirigidos plásmido CAR junto con cinco microgramos de plásmido de envase al otro. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego añadir reactivo de transfección al tubo de plásmido.

Mezclar en pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces e incubarla a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Añadir tres mililitros de la mezcla a las células Phoenix y colocarlos en una incubadora de cultivo de tejido. Después de cuatro a cinco horas añadir un mililitro de FCS a las células y cultivarlos durante la noche a 37 grados Celsius.

Al día siguiente, retire el sobrenadante de las células y agregue cuatro mililitros de medio de cultivo precalificado fresco. Cosecha el virus el segundo día recogiendo el medio que contiene el virus de las células Phoenix y filtrándolo para eliminar los desechos celulares residuales. Añadir acciones humanas IL-2 recombinantes al virus para una concentración final de 200 unidades internacionales por mililitro y utilizarla inmediatamente para la transducción.

Agregue cuatro mililitros de medio fresco a las células Phoenix y colóquelos en la incubadora durante la noche. Repita la recolección de virus al día siguiente para una segunda transducción y deseche las células. Un día antes de sembrar células T8 murinas, añadir un mililitro de una mezcla de anticuerpos antiratón CD3 y CD28 a cada pozo de una placa de 24 pozos e incubar la placa durante la noche a cuatro grados Celsius.

En el día cero, cosecha bazos de ratón y colóquelos en un colador celular empapando en 10 mililitros de PBS en un plato de cultivo celular sobre hielo. En una capucha de cultivo celular, corte cada bazo en tres a cinco piezas y use un émbolo estéril de una jeringa para presionar el tejido a través de la malla de alambre. Retire suavemente los glóbulos rojos resuspendiendo los espleocitos en un oto amortiguador de lelisis de células rojas diluidos e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego diluya 10 microlitros de la suspensión celular con Trypan Blue para el recuento de células.

Y pele el resto de las células centrifugando a 350 veces g durante siete minutos. Utilice un kit de aislamiento de células T CD8 de ratón para enriquecer las células T CD8 y suspender los pellets celulares en 400 microlitros de tampón con 100 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina por uno por 10 a las células octavas. Mezcle bien la suspensión celular e icleine durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados para permitir la unión de anticuerpos.

Luego agregue 300 microlitros de tampón de etiquetado y 200 microlitros de micro-biotina MicroBeads por uno por 10 a las octavas células. Mezclar bien e incubar durante otros 10 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, configure una columna de separación en el separador y lávela con tres mililitros de tampón de etiquetado.

Coloque un colador celular de 40 micrómetros en la parte superior de una columna y pase un mililitro de la mezcla de cordón y célula a través del colador en la columna de separación. Recoger el flujo a través de un tubo de 15 mililitros prechilled y lavar la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante, recogiendo efluentes en el mismo tubo. Contar las células y recogerlas por centrifugación a 350 veces g durante cinco minutos.

Lávelos con dos mililitros de medio de célula t y centrífuga de nuevo. Luego resuspenderlos en medio de células T precalentadas a una concentración de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave las placas recubiertas de anticuerpos CD3 y CD28 previamente preparadas con un mililitro de PBS estéril tres veces y agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada pozo.

Utilice un movimiento de remolino para dispensar las células uniformemente. Como control, vajilla el mismo número de células T CD8 en un único pozo no recubierto de la placa e incuba las células a 37 grados Celsius en una incubadora de tanques de gas de dióxido de carbono del 10% durante 48 horas. En el primer día, preparar placas recubiertas de fragmentos de fibronectina humana añadiendo 0,5 mililitros de fibronectina a los pozos de una placa de 24 pozos e incubando durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, retire la solución de fibronectina y agregue un mililitro de 2%BSA y PBS por pozo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos y lavar los pozos tratados con un mililitro de PBS estéril. La placa está lista para usar después de retirar la solución de lavado.

Cuente las células T CD8 activadas usando Trypan Blue. Recógelos por centrifugación. Y los resuspend a cinco millones de células viables por mililitro para la transducción.

Agregue 100 microlitros de la suspensión de células CD8 activadas a cada pozo de la placa recubierta de fibronectina. Luego agregue 1.5 a dos mililitros del virus previamente preparado que contiene el medio y mezcle usando un movimiento de remolino para dispensar uniformemente las células. Selle la placa en una bolsa Ziploc y centríféquela a 2.000 veces g durante 90 minutos a 37 grados centígrados.

Retire la placa de la centrífuga y lléela a un armario de seguridad biológica. Retire con cuidado la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con el medio. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Centígrados.

Después de cuatro horas, retire un mililitro de medio de cada pozo, reemplácelo por un mililitro de medio de célula T completo preadmanido y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Los aspectos críticos de este protocolo son un virus de alto título, células T activadas en buen estado y el método de transducción adecuado. Las células se teñiron conjuntamente con el tamaño de PE siete conjugados anti-CD8, AF647 conjugado anti-CD3, y BV 421 conjugado anti-CD28 para el análisis citométrico de flujo.

Aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresadas GFP que indica la expresión CAR. También co-expresaron CD28 y CD3. Es importante destacar que todas las células positivas de GFP de prueba también se han cotumizado con tetrámeros I-Ag7 insulina BR3, lo que indica la expresión de CAR en la superficie celular pero no con el tetrómero de control.

Además, las células T DE CAR de prueba y control ordenadas secretaron altos niveles de interferón gamma sólo después de la cocultura con células diana que expresan sus ligandos cognosos, lo que confirma que las células transducidas tienen un fenotipo de células T efector CD8 dirigido hacia el objetivo de los anticuerpos primarios. La transducción de células productoras de virus, el aislamiento de las células T CD8 primarias y la activación de estas células T son los pasos más importantes de este experimento. Tener células T activadas sanas y transducción de estas células T con reactivos adecuados asegura resultados favorables.

Este método se puede utilizar para transducir otras células T, pero debe personalizarse para el tipo de celda T específico. Este protocolo allana el camino para la prevención de la diabetes tipo 1 con la terapia de células T del receptor de antígeno específico del antígeno.