Høy-effektivitet generasjon av antigen-spesifikke primær mus cytotoksisk T celler for funksjonell testing i en autoimmun diabetes modell

Denne protokollen lar deg generere et stort antall funksjonelle antigenspesifikke T-celler som er en ønsket sikker tilnærming i behandling av autoimmune sykdommer. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir deg en svært effektiv transduksjonsprosess og et stort antall funksjonelle T-celler. Denne teknikken kan utvides til å behandle type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer der antigener er kjent.

Videre kan CAR T-celler være en lovende behandling for visse typer kreft. Denne metoden kan brukes til å generere immunceller som uttrykker andre CARs. Det er viktig å ha god akseptert teknikk, lese hele protokollen og planlegge hele eksperimentet på forhånd.

Denne to uker lange protokollen inkluderer mini-trinn og suksess er avhengig av riktig ytelse for hvert trinn. Visuelle demonstrasjoner av denne metoden er avgjørende for elevene å følge riktig. Forbered Phoenix-celler for transinfeksjon som beskrevet i manuskriptet.

Det er god praksis å markere sideveggen der medium vil bli lagt til og fjernet for å minimere blåser av celler. På dag null aspirerer supernatanten fra cellene og vask dem med fem milliliter PBS. Tilsett forsiktig syv milliliter med redusert serum medium dropwise til sideveggen av platen og overføre cellene tilbake til inkubatoren.

Tilsett 1,5 milliliter med redusert serummedium til to 14 millimeter runde bunnpolypropylenrør. Tilsett 40 mikrometer transfeksjonsreagens til et av rørene og 15 mikrogram antistoff omdirigert CAR plasmid sammen med fem mikrogram emballasjeplasmid til den andre. Inkuber rørene ved romtemperatur i fem minutter, og tilsett deretter transfection reagens til plasmidrøret.

Bland ved å forsiktig pipe løsningen opp og ned tre ganger og inkubere den ved romtemperatur i minst 20 minutter. Tilsett tre milliliter av blandingen til Phoenix-cellene og legg dem i en vevskulturinkubator. Etter fire til fem timer legge til en milliliter FCS til cellene og kultur dem over natten på 37 grader Celsius.

På neste dag, fjern supernatant fra cellene og legg til fire milliliter med frisk prewarmed kultur medium. Høst viruset på dag to ved å samle viruset som inneholder medium fra Phoenix-cellene og filtrere det for å fjerne gjenværende celleavfall. Tilsett rekombinant human IL-2 lager til viruset for en endelig konsentrasjon på 200 internasjonale enheter per milliliter og bruk den umiddelbart for transduksjon.

Tilsett fire milliliter friskt medium til Phoenix-cellene og legg dem i inkubatoren over natten. Gjenta virussamlingen neste dag for en ny transduksjon og kast cellene. En dag før seeding murine CD8 T celler, tilsett en milliliter av en blanding av anti-mus CD3 og CD28 antistoffer til hver brønn av en 24 brønnplate og inkubere platen over natten på fire grader Celsius.

På dag null, høst musepleens og legg dem på en cellesil soaking i 10 milliliter PBS i en celle kultur rett på is. I en cellekulturhette, skjær hver milt i tre til fem stykker og bruk et sterilt stempel av en sprøyte for å presse vevet gjennom nettingen. Fjern forsiktig røde blodlegemer ved å bruke miltytter i en til fire fortynnede røde blodlegemer lysis buffer og inkubere dem ved romtemperatur i fem minutter og deretter fortynne 10 mikroliter av cellesuspensjonen med Trypan Blue for celletelling.

Og pellet resten av cellene ved sentrifugering på 350 ganger g i syv minutter. Bruk en mus CD8 T celle isolasjon kit for å berike CD8 T celler og suspendere celle pellets i 400 mikroliter buffer med 100 mikroliter biotin antistoff cocktail per en ganger 10 til åttende celler. Bland cellefjæringen godt og inkuber den i fem minutter ved fire grader Celsius for å tillate antistoffbinding.

Deretter legger du til 300 mikroliter merkingsbuffer og 200 mikroliter anti-biotin microbeads per gang 10 til de åttende cellene. Bland godt og inkuber i ytterligere 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellomtiden setter du opp en separasjonskolonne på separatoren og vasker den med tre milliliter merkingsbuffer.

Sett en 40 mikrometercellesil på toppen av en kolonne og send en milliliter av perlen og celleblandingen gjennom silen inn i separasjonskolonnen. Samle strømmen gjennom i en prechilled 15 milliliter rør og vaske kolonnen i henhold til produsentens retninger, samle avløpsvann i samme rør. Tell cellene og samle dem ved sentrifugering på 350 ganger g i fem minutter.

Vask dem med to milliliter T-cellemedium og sentrifuge igjen. Deretter gjenbruke dem i prewarmed T celle medium i en konsentrasjon på 250, 000 til 500, 000 celler per milliliter. Vask de tidligere tilberedte CD3- og CD28-antistoffbelagte platene med én milliliter steril PBS tre ganger og tilsett to milliliter cellefjæring til hver brønn.

Bruk en virvlende bevegelse for å dispensere celler jevnt. Som en kontroll, plate samme antall CD8 T-celler i en enkelt ikke-belagt brønn av platen og inkubere cellene ved 37 grader Celsius i en 10% karbondioksid gasstank inkubator i 48 timer. På dag én, forberede menneskelig fibronectin fragmentbelagte plater ved å legge til 0,5 milliliter fibronectin til brønnene av en 24-brønns plate og inkubere den over natten på fire grader Celsius.

På neste dag, fjerne fibronectin løsning og legge til en milliliter på 2% BSA og PBS per brønn. Inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter og vask de behandlede brønnene med en milliliter steril PBS. Platen er klar til bruk etter at vaskoppløsningen er fjernet.

Telle aktiverte CD8 T-celler ved hjelp av Trypan Blue. Samle dem ved sentrifugering. Og gjenbruk dem på fem millioner levedyktige celler per milliliter for transduksjon.

Tilsett 100 mikroliter av den aktiverte CD8-cellefjæringen til hver brønn av fibronectinbelagt plate. Tilsett deretter 1,5 til to milliliter av det tidligere forberedte viruset som inneholder medium og bland ved hjelp av en virvlende bevegelse for å jevnt dispensere cellene. Forsegle platen i en Ziploc bag og sentrifuge den på 2, 000 ganger g i 90 minutter ved 37 grader Celsius.

Fjern platen fra sentrifugen og ta den med til et biologisk sikkerhetsskap. Fjern plastposen forsiktig og sørg for at utsiden av platen ikke er forurenset med middels. Overfør platen til en 37 grader Celsius karbondioksid inkubator.

Etter fire timer, fjern en milliliter medium fra hver brønn, bytt den ut med en milliliter forhåndswarmed komplett T-cellemedium og legg platen tilbake i inkubatoren. De kritiske aspektene ved denne protokollen er et høyt titervirus, sunne aktiverte T-celler og riktig transduksjonsmetode. Cellene ble co-farget med PE størrelse syv konjugert anti-CD8, AF647 konjugert anti-CD3, og BV 421 konjugert anti-CD28 for flyt cytometrisk analyse.

Omtrent, 70% av CD8 T-cellene co-uttrykt GFP som indikerer CAR uttrykk. De uttrykte også CD28 og CD3. Viktigere, alle test GFP positive celler også co-farget med I-Ag7 insulin BR3 tetramers som indikerer uttrykk for CAR på celleoverflaten, men ikke med kontroll tetramer.

Videre, den sorterte testen og kontroll CAR T celler hver utskilles høye nivåer av interferon gamma bare etter kokultur med målceller uttrykker sine cognate ligands som bekrefter at de transduserte cellene har en CD8 effektor T celle fenotype rettet mot målet for de overordnede antistoffene. Transduksjon av virusprodusentceller, isolering av primære CD8 T-celler og aktivering av disse T-cellene er de viktigste trinnene i dette eksperimentet. Å ha sunne aktiverte T-celler og transduksjon av disse T-cellene med passende reagenser sikrer gunstige resultater.

Denne metoden kan brukes til å transdusere andre T-celler, men den må tilpasses for den spesifikke T-celletypen. Denne protokollen baner vei for forebygging av type 1 diabetes med antigenspesifikk kimerisk antigenreseptor T celleterapi.