Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

Denne protokol giver dig mulighed for at generere et stort antal funktionelle antigen-specifikke T-celler, som er en ønsket sikker tilgang til behandling af autoimmune sygdomme. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver dig en højeffektiv transduktionsproces og et stort antal funktionelle T-celler. Denne teknik kan udvides til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme, hvor antigener er kendt.

Desuden kan CAR T-celler være en lovende behandling for visse typer af kræft. Denne metode kan bruges til at generere immunceller, der udtrykker andre CARs. Det er vigtigt at have god accepteret teknik, læse hele protokollen og planlægge hele eksperimentet på forhånd.

Denne to uger lange protokol indeholder mini-trin og succes er afhængig af korrekt ydeevne af hvert trin. Visuelle demonstrationer af denne metode er afgørende for eleverne at følge korrekt. Forbered Phoenix celler til transfektion som beskrevet i manuskriptet.

Det er god praksis at markere sidevæggen, hvor medium vil blive tilføjet og fjernet for at minimere blæser ud celler. På dag nul aspirere supernatanten fra cellerne og vask dem med fem milliliter PBS. Tilsæt forsigtigt syv milliliter reduceret serummedium til pladens sidevæg og overfør cellerne tilbage til inkubatoren.

Der tilsættes 1,5 milliliter reduceret serummedium til to 14 millimeter runde polypropylenrør. Der tilsættes 40 mikrometer transfektionsreage til et af rørene, og 15 mikrogram antistof omdirigeret CAR plasmid sammen med fem mikrogram emballage plasmid til den anden. Slangerne inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter, og der tilsættes derefter transfektionsreage til plasmidrøret.

Bland ved forsigtigt at pipettere opløsningen op og ned tre gange og inkubere den ved stuetemperatur i mindst 20 minutter. Tilføj tre milliliter af blandingen til Phoenix celler og placere dem i en væv kultur kuvøse. Efter fire til fem timer tilføje en milliliter FCS til cellerne og kultur dem natten over på 37 grader Celsius.

På den næste dag skal du fjerne supernatanten fra cellerne og tilføje fire milliliter frisk forvarmet kulturmedium. Høst virus på dag to ved at indsamle virus, der indeholder medium fra Phoenix celler og filtrere det til at fjerne resterende cellerester. Der tilsættes rekombinant human IL-2-bestand til virussen for en endelig koncentration på 200 internationale enheder pr. milliliter, og brug den straks til transduktion.

Tilføj fire milliliter frisk medium til Phoenix celler og læg dem i rugemaskine natten over. Gentag virus indsamling på den næste dag for en anden transduktion og kassér cellerne. En dag før såning murine CD8 T-celler, tilsæt en milliliter af en blanding af anti-mus CD3 og CD28 antistoffer til hver brønd af en 24 brønd plade og inkubere pladen natten over ved fire grader Celsius.

På dag nul, høst musen milter og læg dem på en celle si iblødsætning i 10 milliliter PBS i en celle kultur parabol på is. I en cellekulturhætte skæres hver milt i tre til fem stykker, og brug et sterilt stempel af en sprøjte til at presse vævet gennem trådnet. Fjern forsigtigt røde blodlegemer ved at resuspendere miltytter i en til fire fortyndede røde celle lysis buffer og inkubere dem ved stuetemperatur i fem minutter derefter fortynde 10 mikroslitere af cellen suspension med Trypan Blue for celletælling.

Og pellet resten af cellerne ved centrifugering på 350 gange g i syv minutter. Brug en mus CD8 T celle isolation kit til at berige CD8 T-celler og suspendere celle pellets i 400 mikroliter buffer med 100 mikroliter af biotin antistof cocktail pr en gange 10 til den ottende celler. Bland celle suspension godt og inkubere det i fem minutter ved fire grader Celsius at give mulighed for antistof binding.

Derefter tilsættes 300 mikroliter mærkningsbuffer og 200 mikroliter anti-biotinmikroper pr. gange 10 til de ottende celler. Bland godt og inkubere i yderligere 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellemtiden skal du oprette en skillekolonne på separatoren og vaske den med tre milliliter mærkningsbuffer.

Sæt en 40 mikrometercellestud på toppen af en kolonne og før en milliliter af perle- og celleblandingen gennem sien ind i skillesøjlen. Strømmen opsamler til et forskudt 15 milliliterrør, og kolonnen vaskes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og opsaml spildevandet i samme rør. Tæl cellerne og opsaml dem ved centrifugering ved 350 gange g i fem minutter.

Vask dem med to milliliter T-cellemedium og centrifuge igen. Derefter resuspendere dem i prewarmed T celle medium i en koncentration på 250, 000 til 500, 000 celler pr milliliter. De tidligere påbelavede CD3- og CD28-antistofbelagte plader vaskes med en milliliter steril PBS tre gange, og der tilsættes to milliliter cellesuspension til hver brønd.

Brug en hvirvlende bevægelse til at dispensere celler jævnt. Som en kontrol, plade det samme antal CD8 T-celler i en enkelt ikke-belagt brønd af pladen og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i en 10% kuldioxid gastank inkubator i 48 timer. På dag ét, forberede menneskelige fibronectin fragment belagt plader ved at tilføje 0,5 milliliter fibronectin til brøndene af en 24-brønd plade og inkubere det i løbet af natten ved fire grader Celsius.

Den næste dag fjernes fibronectinopløsningen, og der tilsættes en milliliter 2% BSA og PBS pr. brønd. Pladen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter, og de behandlede brønde vaskes med en milliliter steril PBS. Pladen er klar til brug efter fjernelse af vaskeopløsning.

Tæl de aktiverede CD8 T-celler ved hjælp af Trypan Blue. Indsamle dem ved centrifugering. Og resuspend dem på fem millioner levedygtige celler pr milliliter til transduktion.

Der tilsættes 100 mikroliter af den aktiverede CD8-cellesuspension til hver brønd af den fibronectinbelagte plade. Derefter tilsættes 1,5 til to milliliter af den tidligere forberedte virus, der indeholder medium og blandes ved hjælp af en hvirvlende bevægelse til jævnt dispenseret cellerne. Forsegle pladen i en Ziploc taske og centrifuge det på 2, 000 gange g i 90 minutter ved 37 grader Celsius.

Fjern pladen fra centrifugen og tag den med til et biologisk sikkerhedsskab. Fjern forsigtigt plastposen og sørg for, at ydersiden af pladen ikke er forurenet med medium. Overfør pladen til en 37 grader Celsius kuldioxid inkubator.

Efter fire timer fjernes en milliliter medium fra hver brønd, den udskiftes med en milliliter forvarmet komplet T-cellemedium og sætte pladen tilbage i inkubatoren. De kritiske aspekter af denne protokol er en høj titer virus, sunde aktiverede T-celler, og den relevante transduktionsmetode. Cellerne blev co-plettet med PE størrelse syv konjugerede anti-CD8, AF647 konjugerede anti-CD3, og BV 421 konjugeret anti-CD28 for flow cytometrisk analyse.

Ca. 70 % af CD8 T-cellerne udtrykte IRP, hvilket indikerer CAR-udtryk. De har også co-udtrykt CD28 og CD3. Det er vigtigt, at alle de GFP-positive testceller også farves sammen med I-Ag7 insulin BR3 tetramers, som indikerer ekspression af CAR på celleoverfladen, men ikke med kontrolte tetrameren.

Endvidere udskilles de sorterede test- og kontrol-CAR T-celler hver især høje interferongammaniveauer efter cokultur med målceller, der udtrykker deres cognate-ligaander, hvilket bekræfter, at de transanucerede celler har en CD8-effektor T-cellefænotype rettet mod målet for moderantistofferne. Transduktion af virusproducerceller, isolering af primære CD8 T-celler og aktivering af disse T-celler er de vigtigste trin i dette eksperiment. At have sunde aktiverede T-celler og transduktion af disse T-celler med passende reagenser sikrer gunstige resultater.

Denne metode kan bruges til at transduce andre T-celler, men det skal tilpasses til den specifikke T-celletype. Denne protokol baner vejen for forebyggelse af type 1 diabetes med antigen-specifikke kimære antigen receptor T-celle terapi.