Högeffektiv generering av antigen-specifika primära mus cytotoxiska T-celler för funktionell testning i en autoimmun diabetes modell

Detta protokoll kan du generera ett stort antal funktionella antigen-specifika T-celler som är en önskad säker metod vid behandling av autoimmuna sjukdomar. Den största fördelen med denna teknik är att den ger dig en mycket effektiv transduktionsprocess och ett stort antal funktionella T-celler. Denna teknik kan utvidgas till att behandla typ 1-diabetes och andra autoimmuna sjukdomar där antigener är kända.

Vidare kan CAR T-celler vara en lovande behandling för vissa typer av cancer. Denna metod kan användas för att generera immunceller som uttrycker andra CARs. Det är viktigt att ha bra accepterad teknik, läsa hela protokollet och planera hela experimentet i förväg.

Detta två veckor långa protokoll innehåller mini-steg och framgång är beroende av korrekt prestanda för varje steg. Visuella demonstrationer av denna metod är avgörande för att inlärarna ska kunna följa rätt. Förbered Phoenix-celler för transfektion enligt beskrivningen i manuskriptet.

Det är god praxis att markera sidoväggen där medium kommer att läggas till och tas bort för att minimera blåser av celler. På dag noll aspirera supernatanten från cellerna och tvätta dem med fem milliliter PBS. Tillsätt försiktigt sju milliliter reducerat serum medium dropwise till plattans sidovägg och för över cellerna tillbaka till inkubatorn.

Tillsätt 1,5 milliliter av reducerat serum medium till två 14 millimeter rund botten polypropylen rör. Lägg till 40 mikrometer transfektionsreagens till ett av rören och 15 mikrogram antikropp omdirigerad CAR plasmid tillsammans med fem mikrogram förpackningar plasmid till den andra. Inkubera rören i rumstemperatur i fem minuter och tillsätt sedan transfektionsreagens till plasmidröret.

Blanda genom att försiktigt pipettera lösningen upp och ner tre gånger och inkubera den i rumstemperatur i minst 20 minuter. Tillsätt tre milliliter av blandningen till Phoenix cellerna och placera dem i en vävnad kultur inkubator. Efter fyra till fem timmar lägga till en milliliter av FCS till cellerna och odla dem över natten på 37 grader Celsius.

På nästa dag, ta bort supernatanten från cellerna och tillsätt fyra milliliter färskt förvärmda odlingsmedium. Skörda viruset på dag två genom att samla in viruset som innehåller medium från Phoenix celler och filtrera den för att ta bort kvarvarande cell skräp. Lägg till rekombinanta mänskliga IL-2 lager till viruset för en slutlig koncentration av 200 internationella enheter per milliliter och använda den omedelbart för transduktion.

Tillsätt fyra milliliter färskt medium till Phoenix cellerna och placera dem i inkubatorn över natten. Upprepa virusinsamlingen nästa dag för en andra transduktion och kasta cellerna. En dag före sådd murine CD8 T-celler, tillsätt en milliliter av en blandning av anti-mus CD3 och CD28 antikroppar mot varje brunn av en 24 brunnsplatta och inkubera plattan över natten i fyra grader Celsius.

På dag noll, skörda mus mjälte och lägg dem på en cell sil blötläggning i 10 milliliter PBS i en cell kultur skålen på is. I en cellkultur huva, skär varje mjälte i tre till fem bitar och använda en steril kolv av en spruta för att trycka vävnaden genom trådnätet. Ta försiktigt bort röda blodkroppar genom resuspending splenocytes i en till fyra utspädd röd cell lys buffert och inkubera dem i rumstemperatur i fem minuter sedan späda 10 mikroliter av cellen suspension med Trypan Blue för cellräkning.

Och pellet resten av cellerna genom centrifugering vid 350 gånger g i sju minuter. Använd en mus CD8 T cell isolering kit för att berika CD8 T-celler och upphäva cell pellets i 400 mikroliter av buffert med 100 mikroliter av biotin antikropp cocktail per en gånger 10 till den åttonde celler. Blanda cellupphängningen väl och inkubera den i fem minuter vid fyra grader Celsius för att möjliggöra antikroppsbindning.

Lägg sedan till 300 mikroliter av märkningsbuffert och 200 mikroliter av Anti-Biotin MicroBeads per en gånger 10 till de åttonde cellerna. Blanda väl och inkubera i ytterligare 10 minuter vid fyra grader Celsius. Under tiden, inrätta en separation kolumn på avgränsaren och tvätta den med tre milliliter märkning buffert.

Sätt en 40 mikrometer cell sil på toppen av en kolumn och passera en milliliter av pärla och cell blandningen genom silen i separationskolumnen. Samla flödet genom i en prechilled 15 milliliter rör och tvätta kolumnen enligt tillverkarens anvisningar, samla spillvatten i samma rör. Räkna cellerna och samla dem genom centrifugering vid 350 gånger g i fem minuter.

Tvätta dem med två milliliter T-cellmedium och centrifug igen. Sedan resuspend dem i förvärmda T-cell medium vid en koncentration av 250, 000 till 500, 000 celler per milliliter. Tvätta de tidigare beredda CD3- och CD28-antikroppsbelagda plattorna med en milliliter steril PBS tre gånger och tillsätt två milliliter av cellupphängningen till varje brunn.

Använd en virvlande rörelse för att dosera celler jämnt. Som en kontroll, platta samma antal CD8 T-celler i en enda icke-belagd brunn av plattan och inkubera cellerna på 37 grader Celsius i en 10%koldioxid gastank inkubator i 48 timmar. På dag ett, förbereda mänskliga fibronectin fragment belagda plattor genom att lägga till 0,5 milliliter fibronectin till brunnarna i en 24-brunns platta och inkubera den över natten vid fyra grader Celsius.

Nästa dag tar du bort fibronectinlösningen och lägger till en milliliter på 2 %BSA och PBS per brunn. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter och tvätta de behandlade brunnarna med en milliliter steril PBS. Plattan är klar att användas efter att tvätta lösningen tagits bort.

Räkna de aktiverade CD8 T-cellerna med trypanblå. Samla dem genom centrifugering. Och resuspend dem på fem miljoner livskraftiga celler per milliliter för transduktion.

Tillsätt 100 mikroliter av den aktiverade CD8-cellupphängningen till varje brunn av den fibronectinbelagda plattan. Tillsätt sedan 1,5 till två milliliter av det tidigare beredda viruset som innehåller medium och blanda med hjälp av en virvlande rörelse för att jämnt dosera cellerna. Försegla plattan i en Ziploc väska och centrifug den på 2, 000 gånger g i 90 minuter vid 37 grader Celsius.

Ta bort plattan från centrifugen och ta den till ett biologiskt säkerhetsskåp. Ta försiktigt bort plastpåsen och se till att plattans utsida inte kontamineras med medium. Överför plattan till en 37 grader Celsius koldioxid inkubator.

Efter fyra timmar, ta bort en milliliter medium från varje brunn, ersätta den med en milliliter av förvärmda komplett T-cell medium och lägg plattan tillbaka i inkubatorn. De kritiska aspekterna av detta protokoll är ett hög titervirus, friska aktiverade T-celler och lämplig transduktionsmetod. Celler var co-färgas med PE storlek sju konjugerade anti-CD8, AF647 konjugerat anti-CD3 och BV 421 konjugerad anti-CD28 för flöde cytometriska analys.

Ungefär, 70%av CD8 T-celler co-uttryckt GFP som anger CAR uttryck. De var också med och uttryckte CD28 och CD3. Viktigt, alla testet GFP positiva celler också co-färgade med I-Ag7 insulin BR3 tetramers som indikerar uttryck för CAR på cellytan men inte med kontroll tetramer.

Vidare, den sorterade test och kontroll CAR T-celler varje utsöndras höga nivåer av interferon gamma först efter kokultur med målceller uttrycka sina cognate ligander som bekräftar att de transduced cellerna har en CD8 effektor T cell fenotyp riktad mot målet för de överordnade antikroppar. Transduktion av virusproducentceller, isolering av primära CD8 T-celler och aktivering av dessa T-celler är de viktigaste stegen i detta experiment. Med friska aktiverade T-celler och transduktion av dessa T-celler med lämpliga reagenser säkerställer fördelaktiga resultat.

Den här metoden kan användas för att transduce andra T-celler men det måste anpassas för den specifika T-celltypen. Detta protokoll banar väg för förebyggande av typ 1 diabetes med antigen-specifika chimär antigen receptor T cell terapi.