Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации
Chapters
Summary August 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.
Transcript
Количественная мультиплексированная ко-иммунопреципиентация, или ЗМИ, позволяет пользователям одновременно измерять сотни бинарных взаимодействий в предопределенной сети взаимодействия белка. Выполняя несколько со-IPs одновременно в том же лизе, биоинформатики методы могут затем изучить, как группы совместного объединения изменения в скоординированной основе. Анализ отнимая много времени на разработку, но как только панель qMI находится в руке, данные сетевого масштаба могут быть собраны о системах передачи сигналов в относительно просто ночном анализе.
«МИ требует точного пипетки различных образцов и реагентов в 96 пластин. При настройке и запуске каждого анализа следует принимать осторожные заметки для предотвращения ошибок. Для подготовки образца и иммунопреципиентации, начните с облизывания образца в подходящем моющее средство с ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 15 минут инкубации на льду.
В конце инкубации, спина вниз образца для удаления мембран и мусора и выполнить анализ BCA на супернатант, чтобы определить концентрацию белка в соответствии со стандартными протоколами. После нормализации концентрации белка, подготовить магнитный шарик мастер смесь, которая содержит около 250 магнитных бусин каждого класса на колодец. Используйте магнитное разделение для мытья магнитной смеси шарика два раза в буфере Fly P, прежде чем повторно использовать бисер в 20 микролитров буфера Fly P на образец.
После тщательного пипетки, aliquot 20 микролитров бисера в одну ледяную микроцентрифугную трубку на образец и добавить равные объемы лизата с нормализованными концентрациями белка в каждой трубке для иммунопреципиентации. Затем разделите каждый образец лизата на одну трубку для каждой запущенной пластины и проясните образцы на ротаторе при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. На следующее утро используйте магнитную стойку шарика, чтобы удалить лизат из первого набора трубок и мыть бисер два раза в 500 микролитров ледяной Fly P буфера за стирку.
После расчета объема повторного получения, повторное использование иммунопрециатов в расчете объема ледяного буфера Fly P. Тщательно resuspend магнитные бусины нежной пипетки и распространять 25 микролитров бисера на колодец через плоский дном 96 хорошо пластины на льду. В другой пластине 96 хорошо, разбавленный attinilated антителами зонда к 2 временам работая концентрации.
Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 микролитров каждого зонда антитела разбавления в соответствующие скважины магнитной шарик, содержащий анализ пластины и встряхнуть на высокой скорости на горизонтальной шейкер пластины смешивать и повторно магнитных бусин. После смешивания, уменьшить скорость в течение одного часа инкубации на четыре градуса по Цельсию защищены от света. В конце инкубации, мыть пластину три раза со свежим буфером Fly P на стирку на магнитной шайбе пластины при четырех градусах по Цельсию.
После последней стирки, повторно использовать бисер в 50 микролитров стрептавидина PE разбавленной от одного до 200 в буфере Fly P. Встряхните смесь и повторно поместите шарики перед инкубацией пластины при четырех градусах По Цельсию в течение 30 минут, защищенных от света. В конце инкубации трижды вымойте пластину буфером Fly P на шайбе магнитной пластины при четырех градусах по Цельсию и повторно помесив бисер в 125 микролитров буфера Fly P.
Встряхните тарелку в течение одной минуты при 900 вращениях, чтобы тщательно повторно использовать бисер и загрузить пластину в рефрижерированный цитометр потока. В программном обеспечении цитометра потока выберите параметр High RP1 Target, состояние остановки 1000 бусин на область и объем выборки 80 микролитров. Пауза запустить на полпути через и повторно beads для предотвращения урегулирования.
В конце запуска экспортировать файлы данных в формате XML. Для выполнения анализа АНК заполните входной файл АНК, чтобы отразить детали экспериментального проектирования и запустить программу, которая напишет файл CSV в активный каталог. Файл, заканчивающийся хитами.
csv сообщит о со-ассоциациях протеина которые значительно друг на ложноположивном уровне 0.05 между управлением и экспериментальными условиями в по крайней мере 3 из 4 экспериментальных репликаций. Для взвешенного анализа сети корреляции вставьте заголовки столбца вывода файла данных Matlab, заканчивающийся в mfi. csv в первую колонку новой таблицы и добавить столбцы Эксперимент для эксперимента номер и лечение для экспериментального лечения и любых других переменных, которые будут проанализированы.
Сохраните этот файл в качестве признаков. csv и открыть R Studio. Установите рабочий каталог на папку, содержащую мфо.
csv и черты. csv файлы, выделить разделы кода, и ударил Команды Введите для запуска команд R, как указано в прокомментировал командный файл. Взвешенные модули сетевого анализа корреляции, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, будут выводиться в качестве графического файла, а корреляция каждого взаимодействия с каждым модулем будет выводиться в качестве файла CSV.
Для каждого взаимодействия в файле вывода АНК определите, является ли это взаимодействие также значительным CNA, и создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар АНК также хитом CNA. Преобразование значений для изменения двухкратных раз и расчета среднего значения для всех хитов CNA профсоюза АНК. Наконец, сделайте новую таблицу с каждым хитом профсоюза АНК CNA, перечисленным его целью иммунопреципиентации в одной колонке, ее целью зонда во второй колонке и значением изменения складок в третьей колонке.
Импорт этого файла в Cytoscape как сеть для создания диаграммы кромки узла. Взаимодействия белков высокой уверенности, выявленные двумя независимыми статистическими подходами, визуализируются как диаграммы кромок узла с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape или в качестве тепловых карт с использованием R-кода и инструкций по анализу, включенных в дополнительный материал. На протяжении всего протокола, пользователи должны заботиться, чтобы пипетки точно, вести тщательный учет, и держать образцы холодной во все времена.
Мы использовали МИ, чтобы понять, как пути трансдукции сигнала различают различные типы входных данных и интегрируют информацию из нескольких рецепторов.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
