Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi
Chapters
Summary August 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.
Transcript
Kantitatif çokkatlı co-immünoprepitasyon veya QMI, kullanıcıların önceden tanımlanmış bir protein etkileşimağında aynı anda yüzlerce ikili etkileşimi ölçmelerini sağlar. Biyoinformatik teknikleri, aynı anda birden fazla eş-IP gerçekleştirerek, eş-ilişkilendirme gruplarının nasıl eşgüdümlü bir şekilde değiştiğini inceleyebilir. Tahse geliştirmek için zaman alıcı, ancak Bir kez QMI paneli elinde ağ ölçek verileri nispeten basit bir gecede tahse sinyal iletim sistemleri hakkında toplanabilir.
QMI, farklı numunelerin ve reaktiflerin 96 kuyu plakasına doğru şekilde pipetlemesini gerektirir. Hataları önlemek için her bir titreyi kurarken ve çalıştırırken dikkatli notlar alınmalıdır. Numune hazırlama ve immünoprepitasyon için, numuneyi proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile uygun bir deterjanla buz üzerinde 15 dakikalık bir kuluçka için lysing ile başlayın.
Kuluçka sonunda, membranları ve döküntüleri çıkarmak için numuneyi aşağı doğru çevirin ve standart protokollere göre protein konsantrasyonunu belirlemek için süpernatant üzerinde bca tayini yapın. Protein konsantrasyonlarını normale döndürtükten sonra, her sınıf için yaklaşık 250 manyetik boncuk içeren bir manyetik boncuk ana karışımı hazırlayın. Numune başına 20 mikrolitre Fly P tamponu boncukları yeniden sumadan önce fly P tamponunda manyetik boncuk karışımını iki kez yıkamak için manyetik ayırmayı kullanın.
Ayrıntılı bir pipetleme den sonra, numune başına bir buz gibi mikrocentrifuge tüpüne 20 mikrolitre boncuk ekleyin ve immünoprediiçin her tüpe normalleştirilmiş protein konsantrasyonları ile eşit hacimlerde lysat ekleyin. Daha sonra her lysate numunesini çalıştırılan her bir plaka için bir tüpe bölün ve numuneleri ışıktan korunan dört derece lik bir rotatörde bir gecede immünoppresipitate edin. Ertesi sabah tüplerin ilk seti lysate kaldırmak ve yıkama başına buz gibi sinek P tampon 500 mikrolitre boncuk iki kez yıkamak için bir manyetik boncuk raf kullanın.
Resuspension hacmi hesaplandıktan sonra, buz soğuk Fly P tampon hesaplanan hacminde immünoppresipitates resuspend. Manyetik boncukları nazik pipetleme ile iyice askıya alın ve buz üzerinde düz dipli 96 kuyu plakası boyunca her biri 25 mikrolitre boncuk dağıtın. Farklı bir 96 kuyu plaka, iki kez çalışma konsantrasyonu attinilated prob antikorları tarafından seyreltin.
Her probuantikor seyreltme 25 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın manyetik boncuk içeren manyetik boncuk uygun kuyulara ve karıştırmak ve manyetik boncuklar yeniden askıya almak için yatay bir plaka shaker üzerinde yüksek hızda sallamak. Karıştırma sonra, ışıktan korunan dört santigrat derece bir saat kuluçka için hızı azaltmak. Kuluçka sonunda, dört santigrat derece bir manyetik plaka yıkayarak başına taze Fly P tampon ile plaka üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, streptavidin PE 50 mikrolitre boncuk resuspend Fly P tampon bir ila 200 seyreltilmiş. Karışımı salla ve ışığı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce boncukları yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, plakayı manyetik plakalı bir çamaşır makinesinde Fly P tamponuyla üç kez yıkayın ve 125 mikrolitre Fly P tamponundaki boncukları yeniden askıya alın.
900 dönüşte plakayı bir dakika boyunca çalkalayarak boncukları iyice askıya alın ve plakayı yeniden buzdolabına konan akış sitometresine yükleyin. Akış sitometre yazılımında, Yüksek RP1 Hedef ayarı, bölge başına 1.000 boncuk luk bir durdurma koşulu ve 80 mikrolitrelik bir örnek hacmi seçin. Yolu yarıladırve yerleşmeyi önlemek için boncukları askıya alın.
Çalıştırmanın sonunda, veri dosyalarını XML biçiminde dışa aktarın. ANC çözümlemesi gerçekleştirmek için, deneysel tasarımın ayrıntılarını yansıtacak şekilde ANC giriş dosyasını doldurun ve etkin dizine bir CSV dosyası yazacak programı çalıştırın. Dosya isabetle bitiyor.
csv, kontrol ve deneysel koşullar arasında 0,05 yanlış pozitif düzeyde önemli ölçüde farklı olan protein ortak çağrışımlarını dört deneysel kopyadan en az üçünde rapor edecektir. Ağırlıklı korelasyon ağ çözümlemesi için, mfi ile biten Matlab tarafından veri dosyası çıktısının sütun başlıklarını yapıştırın. csv yeni bir elektronik tablonun ilk sütununa ve deney numarası ve deney tedavisi için Tedavi ve analiz edilecek diğer değişkenler için Deney sütunları ekleyin.
Bu dosyayı özellik olarak kaydedin. csv ve açık R Studio. Çalışma dizini mfi içeren bir klasöre ayarlayın.
csv ve özellikleri. csv dosyaları, kod bölümlerini vurgulayın ve yorumlanan Komut dosyasında belirtildiği gibi R komutlarını çalıştırmak için Komut girin'i vurdu. Her bir deneysel özellik ile önemli ölçüde ilişkili ağırlıklı korelasyon ağ analizi modülleri bir grafik dosyası olarak çıktı ve her bir modül ile her etkileşimkore csv dosyası olarak çıktı olacaktır.
ANC çıktı dosyasındaki her etkileşim için, bu etkileşimin CNA tarafından da önemli olup olmadığını belirleyin ve her ANC isabetinin de CNA isabeti olup olmadığını belirten yeni bir sütun oluşturun. Değerleri iki kat değişiklik günlüğe dönüştürün ve tüm ANC birleşim CNA isabetleri için ortalama değeri hesaplayın. Son olarak, immünopredem hedefi tarafından bir sütunda listelenen her ANC birliği CNA isabet, ikinci sütunda sonda hedefi ve üçüncü sütunda kat değişim değeri ile yeni bir elektronik tablo yapın.
Düğüm kenarı diyagramı oluşturmak için bu dosyayı ağ olarak Cytoscape'e aktarın. İki bağımsız istatistiksel yaklaşımla tanımlanan yüksek güven protein etkileşimleri, açık kaynak yazılımı Cytoscape kullanılarak düğüm kenarı diyagramları veya ek malzemede yer alan R kodu ve analiz yönergeleri kullanılarak ısı haritaları olarak görselleştirilmiştir. Protokol boyunca, kullanıcıların pipetlere doğru bir şekilde dikkat etmesi, titiz kayıtları tutması ve numuneleri her zaman soğuk tutması gerekir.
Sinyal transdüksiyon yollarının farklı giriş türleri arasında nasıl ayrım dığını ve birden fazla reseptörden gelen bilgileri nasıl entegre ettiğimizi anlamak için QMI'yi kullandık.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
