Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling
Chapters
Summary August 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) bruker flyt flowcytometri for følsom påvisning av forskjeller i overflod av målrettede protein-protein interaksjoner mellom to prøver. QMI kan utføres ved hjelp av en liten mengde biomaterialet, krever ikke genetisk konstruerte koder, og kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk.
Transcript
Kvantitativ multipleksed co-immunoprecipitation, eller QMI, gjør det mulig for brukere å samtidig måle hundrevis av binære interaksjoner i et forhåndsdefinert protein interaksjonsnettverk. Ved å utføre flere co-IPer samtidig i samme lysate, kan bioinformatikkteknikker deretter undersøke hvordan grupper av samforeninger endres på en koordinert måte. Analysen er tidkrevende å utvikle, men når QMI-panelet er i håndnettverksskaladata kan samles inn om signaltransduksjonssystemer i en relativt enkelt enkelt overnattingsanalyse.
QMI krever nøyaktig pipettering av forskjellige prøver og reagenser i 96 brønnplater. Det bør tas forsiktige notater når du konfigurerer og kjører hver analyse for å forhindre feil. For prøveforberedelse og immunforefall, begynn med å lyse prøven i et egnet vaskemiddel med protease- og fosfatasehemmere for en 15 minutters inkubasjon på is.
På slutten av inkubasjonen, spinn ned prøven for å fjerne membraner og rusk og utføre en BCA-analyse på det overnaturlige for å bestemme proteinkonsentrasjonen i henhold til standardprotokoller. Etter normalisering av proteinkonsentrasjonene, lag en magnetisk perlemesterblanding som inneholder ca. 250 magnetiske perler av hver klasse per brønn. Bruk magnetisk separasjon til å vaske den magnetiske perleblandingen to ganger i Fly P-bufferen før du gjenbruker perlene i 20 mikroliter Fly P-buffer per prøve.
Etter en grundig pipettering, aliquot 20 mikroliter perler i en iskald mikrocentrifuge rør per prøve og legge like mengder lysate med normaliserte proteinkonsentrasjoner til hvert rør for immunoprecipitation. Del deretter hver lysateprøve i ett rør for hver plate som kjøres og immundeprecipitate prøvene på en rotator ved fire grader Celsius over natten beskyttet mot lys. Neste morgen bruker du et magnetisk perlestativ for å fjerne lysatet fra det første settet med rør og vaske perlene to ganger i 500 mikroliter iskald Fly P-buffer per vask.
Etter beregning av resuspensjonsvolumet, gjenbruker immunoprecipitates i det beregnede volumet av iskald Fly P-buffer. Gjenoppus de magnetiske perlene grundig ved mild pipettering og fordel 25 mikroliter per brønn over en flat bunnet 96 brønnplate på is. I en annen 96 brønnplate, fortynnes ved attinilated sondeantistoffer til en to ganger arbeidskonsentrasjon.
Bruk en flerkanals pipette til å fordele 25 mikroliter av hver sonde antistofffortynning i de riktige brønnene til den magnetiske perlen som inneholder analyseplate og rist ved høy hastighet på en horisontal plateshaker for å blande og gjenbruke de magnetiske perlene. Etter blanding, redusere hastigheten for en time inkubasjon ved fire grader Celsius beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask platen tre ganger med fersk Fly P buffer per vask på en magnetisk plate vaskemaskin ved fire grader Celsius.
Etter siste vask, resuspend perlene i 50 mikroliter streptavidin PE fortynnet en til 200 i Fly P buffer. Rist blandingen og resuspend perlene før du inkuberer platen ved fire grader Celsius i 30 minutter beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask platen tre ganger med Fly P-buffer på en magnetisk platevaskeskiven ved fire grader Celsius og gjenoppusser perlene i 125 mikroliter Fly P-buffer.
Rist platen i ett minutt ved 900 rotasjoner for å grundig bruke perlene grundig og laste platen inn i et omridgerated strømningscytometer. I strømningssytometerprogramvaren velger du Høy RP1-målinnstilling, en stoppbetingelse på 1000 perler perler per region og et prøvevolum på 80 mikroliter. Pause løpet halvveis gjennom og resuspend perlene for å hindre bosetting.
På slutten av kjøringen eksporterer du datafilene i XML-formatet. For å utføre ANC-analyse, fyll ut ANC-inndatafilen for å gjenspeile detaljene i eksperimentell design og kjøre programmet, som vil skrive en CSV-fil inn i active directory. Filen som slutter på treff.
csv vil rapportere protein co-assosiasjoner som er betydelig forskjellige på et falskt positivt nivå på 0,05 mellom kontroll og eksperimentelle forhold i minst tre av fire eksperimentelle repliker. For vektet korrelasjonsnettverksanalyse limer du inn kolonnetitlene på datafilutdataene etter Matlab som slutter på mfi. csv i den første kolonnen i et nytt regneark og legge til kolonnene Eksperimenter for eksperimentnummer og behandling for eksperimentell behandling og eventuelle andre variabler som skal analyseres.
Lagre denne filen som egenskaper. csv og åpne R Studio. Sett arbeidsmappen til en mappe som inneholder mfi.
csv og egenskaper. csv-filer, uthev deler av koden og trykk Kommando Enter for å kjøre R-kommandoene som angitt i den kommenterte kommandofilen. De vektede korrelasjonsnettverksanalysemodulene som er betydelig korrelert med hver eksperimentell egenskap, vil bli utdata som en grafisk fil, og korrelasjonen mellom hver interaksjon med hver modul vil bli utdatat som en CSV-fil.
For hver samhandling i ANC-utdatafilen, identifiser om denne samhandlingen også er betydelig av CNA og opprett en ny kolonne som angir om hvert ANC-treff også er et CNA-treff. Konverter verdiene til å logge to ganger endring og beregne gjennomsnittsverdien for alle ANC union CNA treff. Til slutt, lage et nytt regneark med hver ANC union CNA truffet oppført av sin immunoprecipitation mål i en kolonne, sin sonde mål i den andre kolonnen, og dens fold endringsverdi i den tredje kolonnen.
Importer denne filen til Cytoscape som et nettverk for å opprette et nodekantdiagram. Proteininteraksjoner med høy tillit identifisert av de to uavhengige statistiske tilnærmingene visualiseres som nodekantdiagrammer ved hjelp av åpen kildekode-programvaren, Cytoscape, eller som varmekart ved hjelp av R-kode- og analyseinstruksjonene som inngår i tilleggsmaterialet. Gjennom hele protokollen må brukerne ta vare på pipetten nøyaktig, holde grundige poster, og for å holde prøvene kalde til enhver tid.
Vi har brukt QMI til å forstå hvordan signaltransduksjonsveier skiller mellom ulike inndatatyper og integrerer informasjon fra flere reseptorer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
