Medicine
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Summary April 19th, 2020
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我们提出了一种稳健、经济、灵活的方法，用于测量固定/冷冻组织样本中肝细胞数和核球菌的变化，而不需要流动细胞测量。我们的方法提供了肝细胞学的强大样本范围特征，非常适合跟踪肝损伤和疾病的进展。
Transcript
此方法使用户能够从 2D 组织部分生成肝细胞核 DNA 含量的配置文件，用于肝脏发育、再生和慢性疾病的研究。这种自动化的高通量方法可应用于所有 2D 肝组织部分，为所有简单的圆形肝细胞核提供内部校准的核倍数读出。肝细胞核倍体的变化与衰老、慢性肝病和癌症有关。
该技术提供了一种简单的方法，在固定或低温保存的肝脏标本中分析核倍体。原位倍体分析方法作为跟踪肝病进展的研究和临床工具具有相当大的潜力，因为它们不需要组织去隔离或获得新鲜材料。收获穆林肝组织样品后，将肝叶嵌入最佳切削温度介质中填充低温，并立即将霉菌放在干冰上，确保快速冷冻。
要获得冷冻肝叶样品的切片，请将样品切成六微米厚，在每个样品上放置一个标有聚酰胺涂层的幻灯片，在每个样品上放置五秒钟，让每个样品粘在幻灯片上。收集所有切片后，让样品在室温下平衡三到五分钟，然后进行免疫标记。在平衡结束时，将组织部分固定到烟罩中，在PBS中用1毫升4%的半成醛在室温下固定10分钟。
在固定结束时，用三分钟在PBS中清洗的幻灯片，轻轻搅拌。上次洗涤后，干燥每个组织部分周围的区域，并使用疏水笔在每个样品周围画一个圆圈。要渗透样品，在室温下用0.5%非离子表面活性剂在PBS中处理15分钟。
在孵育结束时，在PBS中用温和的搅拌两次洗涤样品三分钟，如所证明的，在室温下用1%牛血清白蛋白、5%马血清和0.2%非离子表面活性剂的过滤溶液阻断非特异性结合，至少一小时。接下来，在潮湿染色室中，用HHF4-alpha抗体在四摄氏度的阻消缓冲液中孵育幻灯片，防止光线。第二天早上，用适当的荧光结合二次抗体在PBS中轻轻搅拌，用过滤后的1%牛血清白蛋白和0.2%的PBS中非离子表面活性剂中稀释，在室温下在不受光线影响下，洗涤两小时。
在孵化结束时，按照演示，将滑梯洗四次，然后用轻柔的搅拌在双蒸馏水中洗两次三分钟。上次洗涤后，将样品与两滴荧光安装介质安装在盖玻片上，并必要时施加温和压力以消除任何气泡。然后，使用传统的荧光显微镜检查幻灯片，以确保良好的固定和免疫标记。
对于荧光图像采集，在高含量成像平台上设置参数，使用适当的荧光信号采集荧光图像。然后扫描样本以获得足够的图像，以获得组织部分的完整覆盖。在扫描结束时，调整软件的核分段参数，以确保核以最佳方式分离并修改阈值强度，以确保 HNF4-alpha 阳性肝细胞和 HNF4-α 阴性非细胞的最佳浇注。
在核量化方面，根据霍赫斯特染色、主要核霍赫斯特强度、核伸长系数、平均核圆度指数、HNF4-alpha状态和基于重心的核X、Y坐标，以平方千分尺设置核区域。要进行肝细胞核倍体分析，首先下载并安装倍体定量分析程序。在 MATLAB 中，导航到工具栏的应用选项卡，然后单击"安装应用"。
打开 Ploidy 应用程序 ML 应用程序安装程序。将显示一条消息以确认安装成功。在每个数据分析文件中，包括一个称为"细胞度量"的工作表，其中包含列中所示的 ploidy 分析所需的所有数据。
对于每个实验条件，提供一个控制数据集，用于计算 2 到 4 N 核倍数校准的内部控制。对于生物复制，将每个电子表格存储在其自己的文件夹中，以增量方式命名文件夹前缀。接下来，启动 Ploidy 应用程序。
将出现 Ploidy 应用程序图形用户界面。单击"控制数据路径"按钮可导航到控件数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。
在"文件夹前缀"中，键入要为输出文件提供的名称。单击"其他数据的路径"按钮并导航到比较数据复制所在的文件夹。然后，此数据路径将显示在接口中。
然后单击"运行"。分析完成后，状态栏将读取"分析完成"。免疫标记后，通过常规荧光显微镜检查所有幻灯片，以确认已获得良好的质量固定和染色。
Hoechst 染料的涂抹或模糊可能表明固定前固定不足或样品降解。在进行自动图像分析之前，应仔细优化核分离和HNF4-alpha阈值参数，以广泛反映荧光显微镜观察到的免疫保持的视觉模式。在图像分析之后，数据应反映非同质细胞数量的增加，以及肝中具有DDC损伤的HNF4-alpha阳性核数的少量但显著减少。
在健康控制肝脏中，大约63%的HNF4-alpha阳性核表现出简单的圆形形态测定。对控制组和DDC治疗组的相对核倍体进行比较，应反映2C和4C肝细胞核的显著损失以及损伤以及大于8C细胞数量的增加。通过检索高含量图像分析软件中特定肝细胞子集的二维位置，可以询问每个倍体子组的相对位置信息。
可进行具有其他抗体（如 Ki-67）的免疫标记，以评估细胞复制，还可以进一步询问肝细胞核形态测定数据，以补充倍体分析。此方法生成的组织范围倍体特征描述了所有圆形肝细胞核的最小 DNA 含量，但不区分单核细胞和双核肝细胞。该方法有可能被调整为考虑细胞周长等参数，以方便双核细胞的识别，并提供细胞倍数的额外读出。
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