Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter
Chapters
Summary August 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en in vitro Live-imaging metode for å visualisere intracellulære transport av organeller og smugling av plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokollen presenterer også en bildeanalyse metodikk for å bestemme laste transport ruter og Kinetics.
Transcript
Vår protokoll kan brukes til å undersøke motilitet og lokalisering av astrocytiske organeller eller proteiner under kontrollerte ekstracellulære miljøer og milde sykdomstilstander. I motsetning til MHA faste preparater, som gir enkle øyeblikksbilder av protein og organelle lokalisering, kan vår levende bildeteknikk brukes til å analysere partikkeldynamikk i individuelle levende astrocytter. Dagen før transfection frø astrocytter på riktig tetthet for avbildning ved 24 til 48 timer etter transfection.
Fortynn leppeaveksjonsreagensen i redusert serummedium til riktig eksperimentell konsentrasjon. Fortynn fem mikrogram dna med høy renhet i 250 mikroliter med redusert serummedium og tilsett fem mikroliter av lipofection enhancer reagens til røret. Bland leppeofeksjonsreagensen med like volum av DNA-fettofeksjonsforsterkeren og inkuber oppløsningen i 15 minutter ved romtemperatur.
På slutten av inkubasjonen fjerner du supernatanten fra astrocyttkulturen og legger til 100 mikroliter av transfeksjonsblandingen dropwise til cellene. Etter seks timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, erstatt transfeksjonskomplekset med et passende volum av astrocyttkulturmedium og returner cellene til cellekulturinkubatoren i ytterligere 24 til 72 timer. 30 minutter før avbildningen, fortynne en passende lysosomal merking sonde i 200 mikroliter astrocytt kultur medium til en arbeidskonsentrasjon av en mikromolar og merke astrocytter med en sonde i 30 minutter ved 37 grader Celsius.
Vask deretter cellene en gang med varmt astrocyttkulturmedium og erstatt vasken med bildemediet. Umiddelbart etter sondemerkingen plasserer du astrocyttkulturbeholderen i riktig adapter på mikroskopstadiet og bruker EBI fluorescenslys, finn cellene som uttrykker fluorescerende proteiner eller sonde. Bruk digitalkameraet til å justere fluorescerende prøvebelysning for å visualisere de valgte cellene og justere fokus og zoome inn i en enkelt celle.
Bruk deretter Zoom- og Bestemt fokus-funksjonene til å hente én enkelt Z-stabel-tidsforløpsserie med en frekvens på ett bilde annethvert sekund for tidsintervaller mellom 300 og 500 sekunder. Lagre og eksporter tidsforløpsbildene som AVI- eller TIFF-stakkfiler. Hvis du vil analysere tidsforløpsbildene, åpner du bildesekvensen for tidsforløp i ImageJ eller Fiji og bruker verktøyet Del kanal til å dele kanalene.
I det åtte bit grønne kanalbildet bruker du segmentert linje-verktøyet til å spore en linje langs partiklenes baner ved hjelp av den samme ønskede retningskonvensjonen for alle filmene, slik at polariteten er konsistent i og på tvers av alle cellene som studeres. Dobbeltklikk linjeverktøyet for å justere linjebredden slik at den samsvarer med tykkelsen på sporet, og kjør Draw Kymo-makroen i Plugin-modulen Kymo ToolBox ved hjelp av en linjebredde på 10. En melding som ber om å kalibrere bildet i tid og rom, vises.
Når kalibrert, kymografer vil bli generert og kan lagres som TIFF-filer. Hvis du vil tilordne partikkelbaner, bruker du segmentert linje-verktøyet til å spore hver partikkel manuelt i kymografen i hele oppkjøpets varighet og bruke ROI-lederen til å registrere hver partikkelbane som et interesseområde. Lagre alle interesseområdene per hver time-lapse video for videre analyse og kjøre Analyser Kymo makro av Kymo ToolBox plugin.
Et vindu vil åpne ber om å definere den ytre retningen av partikkelbevegelse fra kjernen av cellen av interesse fra rullegardinmenyen. Grensehastigheten bør defineres i henhold til følsomheten til programvaren for hver last av interesse, og linjebredden bør justeres for å matche tykkelsen på hver partikkelbane. Log All Data og Log Extrapolated Coordinates bør være for beregning av de ulike transportparametrene.
Klikk ok. Dataene som beregnes for de enkelte sporene, vil da bli samlet per kymograf og lagret i tekstfiler som er spesifikke for hvert bilde. Kombinere cytosin arabinoside behandling med risting basert rensing strategi beriker renheten av astrocytt kulturer over tradisjonelle protokoller som inkluderer rensing trinn bare.
Lipofection basert transfection tillater forbigående uttrykk for proteiner på nivåer som er optimale for live celleavbildning uten å forårsake toksisitet eller påvirker astrocytt levedyktighet. På samme måte tillater bruk av en fluorescerende sonde rask og effektiv merking av sure endolysosomale organeller for sporing av organelledynamikk og astrocytter. Tidsforløpsdataene fra bildet kan brukes til å generere kymografer som sporer lastbevegelse i tid og rom.
I disse kymografene er anterograde bevegelse av den angitte lasten representert av baner med negative bakker, mens retrograd bevegelse er representert av baner med positive bakker. Stasjonære vesikler vises som vertikale baner. I denne analysen viste kvantifisering av fluksen av en bestemt last gjennom et område av astrocytten forskjeller i prosentandelen av modale partikler blant laster som sannsynligvis er representative for deres normale baselinjemotilitet i regionen av astrocytten der filmene ble kjøpt.
Den nøyaktige kartleggingen av endringen i X, Y-posisjon langs fulltidsskalaen for hver partikkel hentet fra kymografen kan også brukes til å evaluere andre bevegelsesparametere, for eksempel lasthastighet og løpelengde. Siden denne protokollen krever høy kvalitet astrocytt kulturer og effektiv last merking, transfection reagens inkubasjon tid og oppkjøp tidslinjen bør justeres for hver plasmid eller last av interesse. Denne protokollen kan endres for å karakterisere transporthendelser i astrocytter som svar på celleskade, toksisitet, patogene mutasjoner, synaptisk aktivitet eller endringer i intra eller ekstracellulært miljø.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
