Biology
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小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达分析
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Summary September 17th, 2019
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翻译核糖体亲和性纯化（TRAP）可实现细胞类型特异性翻译mRNA的快速和高效分离。在这里，我们演示了一种将水动力尾静脉注射与肝脏再填充小鼠模型和TRAP相结合的方法，以检查重新填充肝细胞的表达特征。
Transcript
使用 TRAP-seq，我们可以从特定的细胞类型中分离出RNA，例如在受伤肝脏中重新填充的肝细胞，以分析这些细胞中发生的基因表达变化。它不需要任何步骤来去除组织中不需要的细胞。细胞特异性RNA通过从整个器官的亲和纯化分离。
这项技术帮助我们确定特定细胞对损伤的反应，这有助于确定对抗肝病的新策略或药物。这可以用来识别肝细胞对不同类型的肝损伤的反应。目前，有很少的选择，严重的急性肝损伤，这种方法将有助于线索，我们到新的治疗方法。
这种方法起源于大脑。在肝脏中，我们设想它可以用来检查各种细胞类型的动态变化，肝细胞，胆道细胞，库普弗细胞和内皮细胞，举几例。演示程序将是琥珀王，一个研究生和我的门名。
首先，通过温和的移液重新悬浮磁珠。将磁支架上的珠子收集超过一分钟，然后取出上经剂。然后，从磁性支架上取出微离心管，加入一毫升PBS，然后上下移液清洗珠子。
将管子放回磁性支架上超过一分钟，收集磁珠并取出 PBS。要准备蛋白质L涂层珠子，在重新悬浮和洗涤的磁珠中加入16微升的生物素化蛋白L，如果使用1.5毫升微离心管，则加入1X PBS，使最终体积为1毫升，如果使用2毫升微离心管，或1.5毫升。在室温下，用生物素化蛋白L孵育磁珠35分钟。
然后，将管子放在磁性支架上超过一分钟，取出上清液以收集蛋白质 L 涂层珠。从磁性支架上取出微离心管，用 3%BSA 缓冲液加入一毫升 PBS，然后轻轻移液至少五次，以清洗蛋白 L 涂层珠子。再次，将管子放在磁性支架上超过一分钟，取出上经剂以收集涂层珠子。
再重复 BSA 洗涤四次。接下来，将50微克的GFP抗体19C8和GFP抗体19F7加入蛋白质L涂层珠，在4摄氏度的管旋转器上孵育1小时。要收集亲和力矩阵，请将管子放在磁性支架上超过一分钟，然后取出上经剂。
将管子从磁性支架上拿开，加入一毫升低盐缓冲液。轻轻上下移液，清洗亲和力矩阵，再重复低盐缓冲液再洗两次。将珠子重新填充在200微升的低盐缓冲液中，使200微升的亲和力矩阵。
首先，设置组织研磨机，使PTFE玻璃管在均质过程中可以放在冰上。将四毫升冷解液缓冲液填充到PTFE玻璃管中。将肝脏放在培养皿上。
使用刀分离200至500毫克的肝脏碎片，并进入PTFE玻璃管。将剩余的肝脏组织放入预冷的微离心管中，并在液氮中闪冻。在电机驱动的均质器中均匀化样品，从 300 rpm 开始至少五次冲程，将肝细胞与肝脏结构分离。
每次降低玻璃管。防止呼吸，这可能会导致蛋白质变性，保持溶液下面的害虫。然后，将转速提升至 900 rpm，使肝脏组织完全均匀，至少进行 12 次全冲程。
将落酸转移到标签和预冷却管中，每个管不超过一毫升的落酸。为了开始核解解，将肝脏在4摄氏度下以2000次g离心，10分钟，然后将上流液转移到冰上一个新的预冷却微离心管。将10%NP-40的上半液体积的1/9加入冰上微离心管中，轻轻反转管，混合溶液。
使用微型离心机快速旋转微离心管，加入 10% DOC 的 1/9 样品体积。通过轻轻反转微离心管混合，快速旋转微离心管并在冰上孵育五分钟。将2万次甘酸的核酸盐在4摄氏度下离心10分钟，然后将上流水液转移到新的冰上冷却前的微离心管上。
对于每根管子，将上每根液的1%作为免疫前沉淀控制。将免疫前沉淀控制装置在四摄氏度的管旋转器上放置一夜。格外小心，通过移液轻轻重新暂停亲和矩阵，然后向每个样品添加 200 微升。
在四摄氏度下孵育赖酸盐过夜，在管旋转器上轻轻混合。要分离RNA，请快速旋转微型离心机中含有裂酸的管，然后通过放置在磁架上至少放置一分钟来收集珠子。在额外的微离心管中收集上流液。
在每个管中加入一毫升新鲜高盐缓冲液，然后轻轻移液至少五次，而不产生气泡。将磁性支架上的珠子收集超过一分钟，然后取出上一液。再重复四次洗涤步骤。
然后，从磁性支架上取出微离心管，在室温下放置五分钟以预热。将珠子用0.7微升β-墨二甲醇在100微升的解解缓冲液中，从亲和力基质中释放结合RNA。以最高速度旋转管至少五秒钟，然后快速向下旋转。
然后，在室温下孵育管子10分钟。将管子放在磁性支架上至少一分钟，然后收集上经剂，然后根据试剂盒中的RNA纯化方案立即进行RNA清理。为了达到分离RNA的最大质量，执行所有可选步骤，包括DNase消化和所有RNA洗脱步骤，包括建议将洗脱缓冲液预热至60摄氏度。
在这项研究中，GFP-L10A融合和法赫转基因通过流体动力学注射在含有转波子质粒的诱捕载体中共同传递到肝脏。尼西诺酮的去除引起肝毒性损伤。免疫荧光染色证实了FAH和GFP-L10A融合蛋白的共表达，以及肝脏再填充两周后重新填充的肝细胞。
由于所有肝细胞在AAV8-TBG-Cre注射后都表达GFP-L10A，因此该基质样品产生最高产量的融合蛋白。相反，在野生型对控中，几乎没有任何RNA被检测到，这些对控制没有GP-L10A转基因，这表明 TRAP程序非常具体，背景较低。当 TRAP 用于肝组织使用 GFP-L10A 转导肝细胞重新填充时，获得了丰富的高质量RNA。
相比之下，没有通过生物分析器检测出对阴性对照样品的RNA微量。与静态肝细胞相比，Gsta1表达在重新填充肝细胞时诱导了十倍以上，而由于缺乏输入RNA，未检测到野生型小鼠的 TRAP 隔离 RNA 的阈值周期值。当组织均质时，确保缓慢移动害虫，以防止气化。
隔离RNA后，可以进行高通量测序或qPCR分析基因表达。使用 TRAP-seq，我们现在有一种方法，专门分离RNA从重新填充的肝细胞，并分析在肝脏重新填充期间基因表达的变化。这使我们能够识别在这个过程中改变的基因和治疗肝损伤的潜在治疗目标。
环氧胺和DTT，存在于几个缓冲液中，都是有毒的。应根据体制准则收集和丢弃废物。
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