Login processing...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biology

Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Journal (Biology)

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Journal (Biology)

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Click here for the English version

Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren

Article DOI: 10.3791/60242-v

September 17th, 2019 •

Amber W. Wang¹, Adam M. Zahm¹, Kirk J. Wangensteen^1,2

¹Department of Genetics, University of Pennsylvania, ²Department of Medicine, University of Pennsylvania

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 17th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Oversættelse af ribosom affinitets rensning (Trap) muliggør hurtig og effektiv isolering af celletype specifik oversættelse af mRNA. Her demonstrerer vi en metode, der kombinerer Hydrodynamisk hale-vene injektion i en musemodel af leveren genindsættelse og fælde for at undersøge udtryks profilen for at genbefolde hepatocytter.

Transcript

Med TRAP-seq kan vi isolere RNA'et fra specifikke celletyper, såsom hepatocytterne, der genbefolker i den skadede lever for at analysere de genekspressionsændringer, der forekommer i disse celler. Det kræver ikke nogen skridt til at fjerne uønskede celler fra vævet. Celletypespecifikke RNA er isoleret ved affinitetsrensning fra hele organlysater.

Denne teknik hjælper os med at afgøre, hvordan specifikke celler reagerer på skader, som kan hjælpe med at identificere nye strategier eller lægemidler til bekæmpelse af leversygdom. Dette kunne bruges til at identificere, hvordan leverceller reagerer på forskellige typer af leverskader. I øjeblikket er der få muligheder for alvorlige akutte leverskader og denne metode vil bidrage til at fingerpeg os ind i nye behandlinger.

Denne metode opstod i hjernen. I leveren forestillede vi os, at det kunne bruges til at undersøge dynamiske ændringer i en række celletyper, hepatocytterne, galdegangsceller, Kupffer-celler og endotelceller for at nævne nogle få. Demonstration af proceduren vil være Amber Wang, en kandidat studerende og min mentee.

Til at begynde, resuspend magnetiske perler ved blid pipettering. Saml perlerne på en magnetisk stander i mere end et minut og fjern supernatanten. Fjern derefter mikrocentrifugerøret fra den magnetiske stativ og tilsæt en milliliter PBS, efterfulgt af pipettering op og ned for at vaske perlerne.

Anl. Placer røret tilbage på den magnetiske holder i mere end et minut for at samle perlerne og fjerne PBS. For at forberede protein L-belagt perler, tilsæt 16 mikroliter af biotinyleret protein L til de resuspenderede og vaskede magnetiske perler og tilsæt 1X PBS at gøre det endelige volumen en milliliter, hvis du bruger en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør, eller 1,5 milliliter, hvis du bruger en to-milliliter mikrocentrifuge rør. Inkuber de magnetiske perler med biotinyleret protein L i 35 minutter ved stuetemperatur på en rørrotator.

Derefter placere røret på den magnetiske stå i mere end et minut og fjern supernatanten for at indsamle proteinet L-belagte perler. Fjern mikrocentrifugerøret fra den magnetiske stander, og tilsæt en milliliter PBS med 3%BSA-buffer efterfulgt af blid pipettering mindst fem gange for at vaske proteinet L-belagte perler. Igen, placere røret på den magnetiske stå i mere end et minut og fjern supernatant til at indsamle de belagte perler.

Gentag BSA vask yderligere fire gange. Dernæst tilsættes 50 mikrogram antistoffer for GFP antistof 19C8 og GFP antistof 19F7 hver i proteinet L-belagte perler, og inkubere i en time ved fire grader Celsius på et rør rotator. For at indsamle affinitetsmatrixen skal røret anbringes på den magnetiske stander i mere end et minut, og supernatanten fjernes.

Tag røret væk fra den magnetiske stativ og tilsæt en milliliter lavsalt buffer. Rør forsigtigt op og ned for at vaske affinitetsmatrixen, og gentag den lavsalt buffer, der vasker yderligere to gange. Opslæned perlerne i 200 mikroliter af lav-salt buffer, at gøre 200 mikroliter af affinitet matrix.

Først skal du oprette vævssliberen, så PTFE-glasrørene kan placeres på is under homogenisering. Fyld fire milliliter kold lysisbuffer i PTFE-glasrørene. Læg leveren på en petriskål.

Brug en kniv til at isolere 200 til 500 milligram lever stykker og flytte ind i PTFE glasrør. Placer det resterende levervæv i et forkølet mikrocentrifugerør og flashfrysning i flydende nitrogen. Homogeniser prøverne i en motordrevet homogenisator, begyndende ved 300 omdr./min. i mindst fem slag for at adskille hepatocytter fra leverstrukturen.

Sænk glasrøret hver gang. Undgå befrugtning, som kan forårsage proteindenaturering, ved at holde støderen under opløsningen. Derefter hæve hastigheden til 900 rpm til fuldt homogenisere levervæv i mindst 12 fulde slagtilfælde.

Lysatet overføres til mærkede og forkølede rør med højst en milliliter lysat hver. For at starte nukleare lysis, centrifuge leveren lysate ved 2, 000 gange g ved fire grader Celsius i 10 minutter, derefter overføre supernatant til en ny pre-kølet mikrocentrifuge rør på is. Tilsæt 1/9th af supernatant volumen på 10% NP-40 i mikrocentrifuge røret på is og bland opløsningen ved forsigtigt at vende røret.

Drej hurtigt mikrocentrifugerørene med en minicentrifuge og tilsæt 1/9th af prøvevolumenet på 10%DOC. Bland ved forsigtigt at invertere mikrocentrifugerørene og hurtigt dreje mikrocentrifugerørene ned og inkubere på is i fem minutter. Centrifuge atomlysatet ved 20,000 gange g ved fire grader Celsius i 10 minutter og overfør supernatanten til nye forkølede mikrocentrifugerør på is.

For hvert rør skal du tage 1% af supernatantens samlede volumen ud som en præimmunitetskontrol. Anvend præimmunoprecipitationskontroller på en rørrotator ved fire grader Celsius natten over. Vær ekstra forsigtig med forsigtigt at opsbruge affinitetsmatrixen ved pipettering, og tilsæt derefter 200 mikroliter til hver prøve.

Inkuber lysatet ved fire grader Celsius natten over med blid blanding på et rør rotator. For at isolere RNA, hurtigt dreje ned rørene indeholder lysater i mini centrifuge og indsamle perlerne ved at placere på den magnetiske rack i mindst et minut. Opsamler supernatanten i yderligere mikrocentrifugerør.

Der tilsættes en milliliter frisk høj saltbuffer til hvert rør, efterfulgt af blid pipettering mindst fem gange uden at indføre bobler. Saml perlerne på den magnetiske stå på is i over et minut og fjern supernatanten. Gentag vasketrinnene yderligere fire gange.

Fjern derefter mikrocentrifugerørene fra den magnetiske stander og læg den ved stuetemperatur i fem minutter for at varme op. Opslæm perlerne i 100 mikroliter lysis buffer med 0,7 mikroliter af beta-mercaptoethanol at frigive bundet RNA fra affinitet matrix. Vortex rørene i mindst fem sekunder ved den højeste hastighed og hurtigt spin ned.

Derefter inkuberes rørene ved stuetemperatur i 10 minutter. Anskaf rørene på den magnetiske stand i mindst et minut, opsam derefter supernatanten, og fortsæt straks til RNA-oprydning i henhold til RNA-renseprotokollen i sættet. For at opnå maksimal kvalitet af det isolerede RNA skal du udføre alle valgfrie trin, herunder DNase-fordøjelse og alle RNA-edlutionstrin, herunder den anbefalede forvarmning af elution-bufferen til 60 grader Celsius.

I denne undersøgelse blev GFP-L10A fusion og Fah transgene co-leveret inden for en transposon-holdige plasmid fælde vektor til lever ved hydrodynamisk injektion. Fjernelsen af nitisinon inducerede en toksisk leverskade. Immunfluorescensfarvning bekræftede sameksistensen af FAH og GFP-L10A fusionsproteinet og de repopulerende hepatocytter efter to ugers genindfolkning af lever.

Den quiescent prøve produceret det højeste udbytte af fusion protein, da alle hepatocytes udtrykke GFP-L10A efter AAV8-TBG-Cre injektion. Omvendt var næsten ingen RNA kan påvises i kontrol af vildtypen, som ikke havde GFP-L10A transgene, hvilket indikerer, at TRAP-proceduren er meget specifik og har en lav baggrund. Når TRAP blev brugt på levervæv under genpopulation med GFP-L10A transduced hepatocytes, rigelige høj kvalitet RNA blev opnået.

I modsætning hertil blev der ikke fundet nogen RNA-spor via Bioanalyzer til den negative kontrolprøve. Gsta1-udtrykket blev fremkaldt af over tigange i repopulerende hepatocytter sammenlignet med quiescent hepatocytes, mens der ikke blev påvist nogen tærskelcyklusværdier med TRAP-isoleret RNA fra den vilde typemus på grund af manglende input-RNA. Ved homogenisering af vævet, sørg for at flytte støderen langsomt for at forhindre befrugtning.

Efter isolering af RNA kan sekvensering med høj gennemløb eller qPCR udføres for at analysere genekspression. Med TRAP-seq har vi nu en metode til specifikt at isolere RNA fra at genbefolke hepatocytter og analysere ændringen i genekspression under genudfolkning af leveren. Dette giver os mulighed for at identificere gener, der er ændret i løbet af denne proces og potentielle terapeutiske mål for behandling af leverskader.

Cycloheximide og DTT, som er til stede i flere buffere, er begge giftige. Affald bør indsamles og kasseres i henhold til institutionelle retningslinjer.

X

Simple Hit Counter