Biology
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माउस लिवर में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ेशन
Chapters
Summary September 17th, 2019
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अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (TRAP) सेल प्रकार के विशेष अनुवाद MRNA के तेजी से और कुशल अलगाव सक्षम बनाता है. यहाँ, हम एक विधि है कि जिगर repopulation और TRAP के एक माउस मॉडल में hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन को जोड़ती है repopulating hepatocytes की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच प्रदर्शित करता है.
Transcript
ट्रैप-एसईक्यू के साथ, हम आरएनए को विशिष्ट कोशिका प्रकारों से अलग कर सकते हैं, जैसे कि उन कोशिकाओं में होने वाले जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए घायल जिगर में फिर सेपोपुलित हेपेटोसाइट्स। इसके ऊतकों से अवांछित कोशिकाओं को हटाने के लिए किसी कदम की आवश्यकता नहीं होती है। सेल टाइप-स्पेसिफिक आरएनए को पूरे ऑर्गन लाइट्स से आत्मीयता शुद्धि से अलग किया जाता है।
यह तकनीक हमें यह निर्धारित करने में मदद करती है कि विशिष्ट कोशिकाएं चोटों का जवाब कैसे देती हैं, जो जिगर की बीमारी से लड़ने के लिए नई रणनीतियों या दवाओं की पहचान करने में मदद कर सकती हैं। यह कैसे जिगर की कोशिकाओं जिगर की चोटों के विभिन्न प्रकार के लिए प्रतिक्रिया की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान में, गंभीर तीव्र जिगर की चोटों के लिए कुछ विकल्प हैं और इस विधि से हमें नए उपचार में सुराग देने में मदद मिलेगी।
इस विधि की उत्पत्ति मस्तिष्क में हुई। जिगर में, हमने कल्पना की कि इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों, हेपेटोसाइट्स, पित्त वाहिनी कोशिकाओं, कुफर कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं में गतिशील परिवर्तनों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन एंबर वांग, एक स्नातक छात्र और मेरे mentee होगा ।
शुरू करने के लिए, कोमल पाइपिंग द्वारा चुंबकीय मोतियों को फिर से रखना। एक मिनट से अधिक समय तक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों को इकट्ठा करें और सुपरनेट को हटा दें। फिर, चुंबकीय स्टैंड से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को हटा दें और पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद मोतियों को धोने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करें।
मोतियों को इकट्ठा करने और पीबीएस को हटाने के लिए एक मिनट से अधिक समय तक ट्यूब को वापस चुंबकीय स्टैंड पर रखें। प्रोटीन एल-लेपित मोतियों को तैयार करने के लिए, बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन एल के 16 माइक्रोलीटर को पुनर्संरक्षित और धोया चुंबकीय मोतियों में जोड़ें और अंतिम मात्रा एक मिलीलीटर बनाने के लिए 1X पीबीएस जोड़ें, यदि एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब का उपयोग करते हैं, या 1.5 मिलीलीटर, यदि दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब का उपयोग करते हैं। एक ट्यूब रोटेटर पर कमरे के तापमान पर 35 मिनट के लिए बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन एल के साथ चुंबकीय मोतियों को इनक्यूबेट करें।
इसके बाद ट्यूब को एक मिनट से अधिक समय तक मैग्नेटिक स्टैंड पर रखें और प्रोटीन एल-कोटेड मोतियों को इकट्ठा करने के लिए सुपरनेट निकाल दें। चुंबकीय स्टैंड से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को हटा दें और 3% बीएसए बफर के साथ पीबीएस का एक मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद प्रोटीन एल-कोटेड मोतियों को धोने के लिए कम से कम पांच बार कोमल पाइपिंग करें। फिर, ट्यूब को एक मिनट से अधिक समय तक चुंबकीय स्टैंड पर रखें और कोटेड मोतियों को इकट्ठा करने के लिए सुपरनैंट को हटा दें।
बीएसए को चार बार एक और धोने दोहराएं। इसके बाद, जीएफपी एंटीबॉडी 19C8 और जीएफपी एंटीबॉडी 19F7 प्रत्येक प्रोटीन एल-लेपित मोतियों में प्रत्येक के लिए एंटीबॉडी के 50 माइक्रोग्राम जोड़ें, और एक ट्यूब रोटेटर पर चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। आत्मीयता मैट्रिक्स को इकट्ठा करने के लिए, ट्यूब को एक मिनट से अधिक समय तक चुंबकीय स्टैंड पर रखें और सुपरनेट को हटा दें।
ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड से दूर ले जाएं और कम नमक वाले बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। आत्मीयता मैट्रिक्स को धोने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें और कम नमक बफर को दो बार धोने को दोहराएं। कम नमक बफर के 200 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें, 200 माइक्रोलीटर एफ़िनिटी मैट्रिक्स बनाने के लिए।
सबसे पहले टिश्यू ग्राइंडर सेट करें ताकि समरूपता के दौरान पीएफई ग्लास ट्यूब को बर्फ पर रखा जा सके। चार मिलीलीटर कोल्ड लाइसिस बफर को पीएफई ग्लास ट्यूब में भरें। एक पेट्री डिश पर जिगर रखना।
200 से 500 मिलीग्राम लिवर के टुकड़ों को अलग करने और पीएफई ग्लास ट्यूब में जाने के लिए चाकू का उपयोग करें। बचे हुए लिवर टिश्यू को प्री-ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें और लिक्विड नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें। एक मोटर संचालित समरूप में नमूनों को समरूप बनाना, जिगर की संरचना से हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए कम से पांच स्ट्रोक के लिए ३०० आरपीएम से शुरू होता है ।
हर बार कांच की ट्यूब कम करें। वातारण को रोकें, जो समाधान के नीचे मूसल रखकर प्रोटीन डेनैचिंग का कारण बन सकता है। फिर, कम से कम 12 पूर्ण स्ट्रोक के लिए यकृत ऊतकों को पूरी तरह से समरूप बनाने के लिए गति को 900 आरपीएम तक बढ़ाएं।
lysate को लेबल और प्री-ठंडा ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें प्रत्येक को एक मिलीलीटर से अधिक नहीं है। न्यूक्लियर लाइसिस शुरू करने के लिए लिवर को 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 2, 000 बार जी पर अपकेंद्री करें, फिर सुपरनेट को बर्फ पर एक नई प्री-ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बर्फ पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 10% एनपी-40 की सुपरनेट वॉल्यूम का 1/9वां जोड़ें और ट्यूब को धीरे-धीरे उलटा करके घोल मिलाएं।
माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को मिनी सेंट्रलाइज के साथ जल्दी से नीचे स्पिन करें और 10% डॉक्टर के सैंपल वॉल्यूम का 1/9वां जोड़ें। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को धीरे-धीरे उलटा करके मिलाएं और जल्दी से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को नीचे स्पिन करें और पांच मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें । अपकेंद्रित्र परमाणु 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 20, 000 बार जी पर और बर्फ पर नए पूर्व ठंडा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए supernatant हस्तांतरण ।
प्रत्येक ट्यूब के लिए, सुपरनेट की कुल मात्रा का 1% प्री-इम्यूनोप्रिपिटेशन नियंत्रण के रूप में लें। एक ट्यूब रोटेटर पर प्री-इम्यूनोप्रिपिटेशन कंट्रोल को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। धीरे-धीरे पिपटिंग द्वारा एफ़िनिटी मैट्रिक्स को फिर से खर्च करने के लिए अतिरिक्त देखभाल करें, फिर प्रत्येक नमूने में 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।
एक ट्यूब रोटेटर पर कोमल मिश्रण के साथ रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर lysates इनक्यूबेट । आरएनए को अलग करने के लिए, मिनी सेंट्रलाइज में lysates युक्त ट्यूबों को जल्दी से नीचे स्पिन करें और कम से कम एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखकर मोतियों को इकट्ठा करें। अतिरिक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में सुपरनिटेंट ले लीजिए।
प्रत्येक ट्यूब में ताजा उच्च नमक बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, इसके बाद बुलबुले को पेश किए बिना कम से कम पांच बार कोमल पिपटिंग करें। एक मिनट से अधिक के लिए बर्फ पर चुंबकीय स्टैंड पर मोती ले लीजिए और सुपरनैंट हटा दें। धुलाई के चरणों को चार बार दोहराएं।
फिर, चुंबकीय स्टैंड से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब निकालें और गर्म होने के लिए पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। एफ़िनिटी मैट्रिक्स से बंधे आरएनए को छोड़ने के लिए बीटा-मर्केप्टोएथेनॉल के 0.7 माइक्रोलीटर के साथ लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। भंवर उच्चतम गति से कम से कम पांच सेकंड के लिए ट्यूबों और जल्दी से नीचे स्पिन।
फिर, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। ट्यूबों को कम से कम एक मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें, फिर सुपरनेट इकट्ठा करें और किट में आरएनए शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए सफाई के लिए तुरंत आगे बढ़ें। अलग आरएनए की अधिकतम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, DNase पाचन और सभी आरएनए एल्यूशन चरणों सहित सभी वैकल्पिक चरणों, 60 डिग्री सेल्सियस करने के लिए एल्यूशन बफर की सिफारिश की पूर्वहीटिंग सहित प्रदर्शन करते हैं।
इस अध्ययन में, GFP-L10A संलयन और Fah ट्रांसजीन को हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन द्वारा यकृत को ट्रांसपोसन युक्त प्लाज्मिड ट्रैप वेक्टर के भीतर सह-वितरित किया गया था। नितिसिनोन को हटाने से विषाक्त जिगर की चोट प्रेरित हुई। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला FAH और GFP-L10A संलयन प्रोटीन और जिगर की पुनर्आबादी के दो सप्ताह के बाद फिर से उठाने हेपेटोसाइट्स के सहउत्साहन की पुष्टि की ।
शांत नमूने संलयन प्रोटीन की सबसे अधिक उपज का उत्पादन किया, के बाद से सभी hepatocytes एक्सप्रेस GFP-L10A AAV8-TBG-Cre इंजेक्शन के बाद । इसके विपरीत, बमुश्किल किसी भी आरएनए जंगली प्रकार के नियंत्रण में पता लगाने योग्य था कि GFP-L10A ट्रांसजीन नहीं था, जाल प्रक्रिया का संकेत अत्यधिक विशिष्ट है और एक कम पृष्ठभूमि है । जब ट्रैप का उपयोग जीएफपी-एल10ए ट्रांसड्यूड हेपेटोसाइट्स के साथ पुनर्आबादी के दौर से गुजर रहे जिगर के ऊतकों पर किया गया था, प्रचुर मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त किए गए थे।
इसके विपरीत, नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए बायोएनालाइजर के माध्यम से कोई आरएनए ट्रेस नहीं पाया गया था। Gsta1 अभिव्यक्ति को शांत हेपेटोसाइट्स की तुलना में हेपेटोसाइट्स को फिर से लागू करने में दस गुना से अधिक प्रेरित किया गया था, जबकि इनपुट आरएनए की कमी के कारण जंगली प्रकार के माउस से ट्रैप-पृथक आरएनए के साथ कोई सीमा चक्र मूल्य नहीं पाया गया था। ऊतक को समरूप बनाते समय, वातारण को रोकने के लिए मूसल को धीरे-धीरे स्थानांतरित करना सुनिश्चित करें।
आरएनए को अलग-थलग करने के बाद जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग या क्यूपीसीआर किया जा सकता है । जाल-seq के साथ, अब हमारे पास विशेष रूप से आरएनए को हेपेटोसाइट्स को फिर से अलग करने और जिगर की पुनर्आबादी के दौरान जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने की एक विधि है। यह हमें जीन है कि इस प्रक्रिया के दौरान बदल रहे है और जिगर की चोट के उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने की अनुमति देता है ।
साइक्लोहेक्सीमाइड और डीटीटी, जो कई बफ़र्स में मौजूद हैं, दोनों जहरीले हैं। कचरे को संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार एकत्र और त्याग दिया जाना चाहिए ।
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