Login processing...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biology

Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Journal (Biology)

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Journal (Biology)

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Click here for the English version

Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver

Article DOI: 10.3791/60242-v

September 17th, 2019 •

Amber W. Wang¹, Adam M. Zahm¹, Kirk J. Wangensteen^1,2

¹Department of Genetics, University of Pennsylvania, ²Department of Medicine, University of Pennsylvania

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 17th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) muliggjør rask og effektiv isolering av celle type-spesifikke oversette mRNA. Her viser vi en metode som kombinerer hydrodynamisk hale-blodåre injeksjon i en mus modell av leveren Repopulation og TRAP å undersøke uttrykket profilen til repopulating hepatocytter.

Transcript

Med TRAP-seq kan vi isolere RNA fra bestemte celletyper, for eksempel hepatocytter som repopulerer i skadet lever for å analysere genuttrykksendringene som forekommer i disse cellene. Det krever ingen trinn for å fjerne uønskede celler fra vevet. Celletypespesifikke RNA er isolert ved affinitetsrensing fra hele orgellylater.

Denne teknikken hjelper oss med å avgjøre hvordan spesifikke celler reagerer på skader, noe som kan bidra til å identifisere nye strategier eller legemidler for å bekjempe leversykdom. Dette kan brukes til å identifisere hvordan leverceller reagerer på ulike typer leverskader. Foreløpig er det få alternativer for alvorlige akutte leverskader, og denne metoden vil bidra til å gi oss en ledetråd til nye behandlinger.

Denne metoden oppsto i hjernen. I leveren så vi for oss at den kunne brukes til å undersøke dynamiske endringer i en rekke celletyper, hepatocytter, gallekanalceller, Kupffer-celler og endotelceller for å nevne noen. Å demonstrere prosedyren vil være Amber Wang, en utdannet student og min mentee.

For å begynne, resuspend magnetiske perler ved mild pipettering. Samle perlene på et magnetisk stativ i mer enn ett minutt og fjern det overnaturlige. Fjern deretter mikrocentrifugerøret fra magnetstativet og tilsett en milliliter PBS, etterfulgt av pipettering opp og ned for å vaske perlene.

Plasser røret tilbake på magnetstativet i mer enn ett minutt for å samle perlene og fjerne PBS. For å forberede protein L-belagte perler, tilsett 16 mikroliter biotinyler protein L til de resuspenderte og vasket magnetiske perler og tilsett 1X PBS for å gjøre det endelige volumet en milliliter, hvis du bruker et 1,5-milliliter mikrocentrifugerør, eller 1,5 milliliter, hvis du bruker et to milliliter mikrocentrifugerør. Inkuber de magnetiske perlene med biotinylert protein L i 35 minutter ved romtemperatur på en rørrotator.

Deretter plasserer du røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjerner det overnaturlige for å samle proteinet L-belagte perler. Fjern mikrocentrifugerøret fra magnetstativet og tilsett en milliliter PBS med 3% BSA-buffer, etterfulgt av mild pipettering minst fem ganger for å vaske proteinet L-belagte perler. Igjen, plasser røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjern supernatanten for å samle de bebelagte perlene.

Gjenta BSA vask ytterligere fire ganger. Deretter legger du til 50 mikrogram antistoffer for GFP antistoff 19C8 og GFP antistoff 19F7 hver inn i proteinet L-belagte perler, og inkubere i en time ved fire grader Celsius på en rørrotator. For å samle affinitetsmatrisen, legg røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjern det overnaturlige.

Ta røret bort fra magnetstativet og tilsett en milliliter med lavsaltbuffer. Rør forsiktig opp og ned for å vaske affinitetsmatrisen og gjenta lavsaltbufferen som vasker ytterligere to ganger. Resuspend perlene i 200 mikroliter med lav-salt buffer, for å lage 200 mikroliter affinitet matrise.

Først setter du opp vevskvernen slik at PTFE-glassrørene kan plasseres på is under homogenisering. Fyll fire milliliter kald lysisbuffer i PTFE-glassrørene. Legg leveren på en petriskål.

Bruk en kniv til å isolere 200 til 500 milligram leverbiter og flytte inn i PTFE glassrør. Plasser gjenværende levervev i et forkjølet mikrocentrifugerør og blits fryse i flytende nitrogen. Homogenisere prøvene i en motordrevet homogenisator, starter på 300 rpm for minst fem slag for å fjerne hepatocytter fra leverstrukturen.

Senk glassrøret hver gang. Forhindre øl, noe som kan forårsake proteindening, ved å holde pestle under løsningen. Deretter øker du hastigheten til 900 rpm for å fullstendig homogenisere levervevet i minst 12 fulle slag.

Overfør lysatet til merkede og forkjølte rør med ikke mer enn en milliliter lysate hver. For å starte kjernefysisk lysis, sentrifugere leveren lysate på 2, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 10 minutter, og deretter overføre supernatant til en ny pre-kjølt mikrocentrifuge tube på is. Tilsett 1/9th av det overnaturlige volumet på 10% NP-40 i mikrocentrifugerøret på is og bland løsningen ved å forsiktig invertere røret.

Spinn raskt ned mikrocentrifugerørene med en mini sentrifuge og tilsett 1/9th av prøvevolumet på 10% DOC. Bland ved å forsiktig invertere mikrocentrifugerørene og raskt spinne ned mikrocentrifugerørene og inkubere på is i fem minutter. Sentrifuger atomlysatet på 20 000 ganger g ved fire grader Celsius i 10 minutter og overfør supernatanten til nye prekjølte mikrocentrifugerør på is.

For hvert rør, ta ut 1% av det totale volumet av supernatant som en pre-immunoprecipitation kontroll. Plasser pre-immunoprecipitation kontrollene på en rør rotator på fire grader Celsius over natten. Vær ekstra forsiktig for å forsiktig bruke affinitetsmatrisen ved å pipettering, og legg deretter til 200 mikroliter i hver prøve.

Inkuber lysates på fire grader Celsius over natten med mild blanding på en rør rotator. For å isolere RNA, snurr raskt ned rørene som inneholder lysates i mini sentrifuge og samle perlene ved å plassere på magnetstativet i minst ett minutt. Samle supernatant i ekstra mikrocentrifuge rør.

Tilsett en milliliter fersk høysaltbuffer til hvert rør, etterfulgt av skånsom pipettering minst fem ganger uten å introdusere bobler. Samle perlene på det magnetiske stativet på is i over ett minutt og fjern det overnaturlige. Gjenta vasketrinnene ytterligere fire ganger.

Fjern deretter mikrocentrifugerørene fra magnetstativet og plasser ved romtemperatur i fem minutter for å varme opp. Resuspend perlene i 100 mikroliter lysis buffer med 0,7 mikroliter beta-mercaptoetanol for å frigjøre bundet RNA fra affinitetsmatrisen. Vortex rørene i minst fem sekunder med høyeste hastighet og raskt spinne ned.

Deretter inkubere rørene ved romtemperatur i 10 minutter. Plasser rørene på magnetstativet i minst ett minutt, samle deretter supernatanten og fortsett umiddelbart til RNA-opprydding i henhold til RNA-renseprotokollen i settet. For å oppnå maksimal kvalitet på den isolerte RNA, utfør alle valgfrie trinn, inkludert DNase fordøyelse og alle RNA elution trinn, inkludert anbefalt forvarming av elution buffer til 60 grader Celsius.

I denne studien ble GFP-L10A fusjon og Fah transgener levert i en transposonholdig plasmidfellevektor til lever ved hydrodynamisk injeksjon. Fjerning av nitisinin induserte en giftig leverskade. Immunofluorescence farging bekreftet samtidiguttrykk av FAH og GFP-L10A fusjonprotein og repopulating hepatocytter etter to uker med lever repopulation.

Den quiescent prøven produsert det høyeste utbyttet av fusjon protein, siden alle hepatocytter uttrykke GFP-L10A etter AAV8-TBG-Cre injeksjon. Omvendt var knapt noen RNA påviselig i wild-type kontroller som ikke hadde GFP-L10A transgene, noe som indikerer trap prosedyren er svært spesifikk og har lav bakgrunn. Når TRAP ble brukt på levervev gjennomgår repopulation med GFP-L10A transdusert hepatocytter, rikelig høy kvalitet RNA ble oppnådd.

I motsetning ble det ikke oppdaget RNA-spor via Bioanalyzer for den negative kontrollprøven. Gsta1-uttrykket ble indusert av over tidoblet i repopulating hepatocytter sammenlignet med quiescent hepatocytter, mens ingen terskelsyklusverdier ble oppdaget med TRAP-isolert RNA fra villtypemusen på grunn av mangel på inngang RNA. Når du homogeniserer vevet, sørg for å bevege pestle sakte for å forhindre aerasjon.

Etter å ha isolert RNA, kan høy gjennomstrømningssekvensering eller qPCR utføres for å analysere genuttrykk. Med TRAP-seq har vi nå en metode for å isolere RNA spesifikt fra å reponere hepatocytter og analysere endringen i genuttrykk under leverrebefolkning. Dette gjør at vi kan identifisere gener som endres under denne prosessen og potensielle terapeutiske mål for behandling av leverskade.

Cykloheximid og DTT, som er tilstede i flere buffere, er begge giftige. Avfall skal samles inn og kastes i henhold til institusjonelle retningslinjer.

X

Simple Hit Counter