Journal
/
/
Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver
JoVE Journal
Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biology
Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver

7,514 Views

10:06 min

September 17, 2019

DOI:

10:06 min
September 17, 2019

9 Views
, ,

Transcript

Automatically generated

Med TRAP-seq kan vi isolere RNA fra bestemte celletyper, for eksempel hepatocytter som repopulerer i skadet lever for å analysere genuttrykksendringene som forekommer i disse cellene. Det krever ingen trinn for å fjerne uønskede celler fra vevet. Celletypespesifikke RNA er isolert ved affinitetsrensing fra hele orgellylater.

Denne teknikken hjelper oss med å avgjøre hvordan spesifikke celler reagerer på skader, noe som kan bidra til å identifisere nye strategier eller legemidler for å bekjempe leversykdom. Dette kan brukes til å identifisere hvordan leverceller reagerer på ulike typer leverskader. Foreløpig er det få alternativer for alvorlige akutte leverskader, og denne metoden vil bidra til å gi oss en ledetråd til nye behandlinger.

Denne metoden oppsto i hjernen. I leveren så vi for oss at den kunne brukes til å undersøke dynamiske endringer i en rekke celletyper, hepatocytter, gallekanalceller, Kupffer-celler og endotelceller for å nevne noen. Å demonstrere prosedyren vil være Amber Wang, en utdannet student og min mentee.

For å begynne, resuspend magnetiske perler ved mild pipettering. Samle perlene på et magnetisk stativ i mer enn ett minutt og fjern det overnaturlige. Fjern deretter mikrocentrifugerøret fra magnetstativet og tilsett en milliliter PBS, etterfulgt av pipettering opp og ned for å vaske perlene.

Plasser røret tilbake på magnetstativet i mer enn ett minutt for å samle perlene og fjerne PBS. For å forberede protein L-belagte perler, tilsett 16 mikroliter biotinyler protein L til de resuspenderte og vasket magnetiske perler og tilsett 1X PBS for å gjøre det endelige volumet en milliliter, hvis du bruker et 1,5-milliliter mikrocentrifugerør, eller 1,5 milliliter, hvis du bruker et to milliliter mikrocentrifugerør. Inkuber de magnetiske perlene med biotinylert protein L i 35 minutter ved romtemperatur på en rørrotator.

Deretter plasserer du røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjerner det overnaturlige for å samle proteinet L-belagte perler. Fjern mikrocentrifugerøret fra magnetstativet og tilsett en milliliter PBS med 3% BSA-buffer, etterfulgt av mild pipettering minst fem ganger for å vaske proteinet L-belagte perler. Igjen, plasser røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjern supernatanten for å samle de bebelagte perlene.

Gjenta BSA vask ytterligere fire ganger. Deretter legger du til 50 mikrogram antistoffer for GFP antistoff 19C8 og GFP antistoff 19F7 hver inn i proteinet L-belagte perler, og inkubere i en time ved fire grader Celsius på en rørrotator. For å samle affinitetsmatrisen, legg røret på magnetstativet i mer enn ett minutt og fjern det overnaturlige.

Ta røret bort fra magnetstativet og tilsett en milliliter med lavsaltbuffer. Rør forsiktig opp og ned for å vaske affinitetsmatrisen og gjenta lavsaltbufferen som vasker ytterligere to ganger. Resuspend perlene i 200 mikroliter med lav-salt buffer, for å lage 200 mikroliter affinitet matrise.

Først setter du opp vevskvernen slik at PTFE-glassrørene kan plasseres på is under homogenisering. Fyll fire milliliter kald lysisbuffer i PTFE-glassrørene. Legg leveren på en petriskål.

Bruk en kniv til å isolere 200 til 500 milligram leverbiter og flytte inn i PTFE glassrør. Plasser gjenværende levervev i et forkjølet mikrocentrifugerør og blits fryse i flytende nitrogen. Homogenisere prøvene i en motordrevet homogenisator, starter på 300 rpm for minst fem slag for å fjerne hepatocytter fra leverstrukturen.

Senk glassrøret hver gang. Forhindre øl, noe som kan forårsake proteindening, ved å holde pestle under løsningen. Deretter øker du hastigheten til 900 rpm for å fullstendig homogenisere levervevet i minst 12 fulle slag.

Overfør lysatet til merkede og forkjølte rør med ikke mer enn en milliliter lysate hver. For å starte kjernefysisk lysis, sentrifugere leveren lysate på 2, 000 ganger g ved fire grader Celsius i 10 minutter, og deretter overføre supernatant til en ny pre-kjølt mikrocentrifuge tube på is. Tilsett 1/9th av det overnaturlige volumet på 10% NP-40 i mikrocentrifugerøret på is og bland løsningen ved å forsiktig invertere røret.

Spinn raskt ned mikrocentrifugerørene med en mini sentrifuge og tilsett 1/9th av prøvevolumet på 10% DOC. Bland ved å forsiktig invertere mikrocentrifugerørene og raskt spinne ned mikrocentrifugerørene og inkubere på is i fem minutter. Sentrifuger atomlysatet på 20 000 ganger g ved fire grader Celsius i 10 minutter og overfør supernatanten til nye prekjølte mikrocentrifugerør på is.

For hvert rør, ta ut 1% av det totale volumet av supernatant som en pre-immunoprecipitation kontroll. Plasser pre-immunoprecipitation kontrollene på en rør rotator på fire grader Celsius over natten. Vær ekstra forsiktig for å forsiktig bruke affinitetsmatrisen ved å pipettering, og legg deretter til 200 mikroliter i hver prøve.

Inkuber lysates på fire grader Celsius over natten med mild blanding på en rør rotator. For å isolere RNA, snurr raskt ned rørene som inneholder lysates i mini sentrifuge og samle perlene ved å plassere på magnetstativet i minst ett minutt. Samle supernatant i ekstra mikrocentrifuge rør.

Tilsett en milliliter fersk høysaltbuffer til hvert rør, etterfulgt av skånsom pipettering minst fem ganger uten å introdusere bobler. Samle perlene på det magnetiske stativet på is i over ett minutt og fjern det overnaturlige. Gjenta vasketrinnene ytterligere fire ganger.

Fjern deretter mikrocentrifugerørene fra magnetstativet og plasser ved romtemperatur i fem minutter for å varme opp. Resuspend perlene i 100 mikroliter lysis buffer med 0,7 mikroliter beta-mercaptoetanol for å frigjøre bundet RNA fra affinitetsmatrisen. Vortex rørene i minst fem sekunder med høyeste hastighet og raskt spinne ned.

Deretter inkubere rørene ved romtemperatur i 10 minutter. Plasser rørene på magnetstativet i minst ett minutt, samle deretter supernatanten og fortsett umiddelbart til RNA-opprydding i henhold til RNA-renseprotokollen i settet. For å oppnå maksimal kvalitet på den isolerte RNA, utfør alle valgfrie trinn, inkludert DNase fordøyelse og alle RNA elution trinn, inkludert anbefalt forvarming av elution buffer til 60 grader Celsius.

I denne studien ble GFP-L10A fusjon og Fah transgener levert i en transposonholdig plasmidfellevektor til lever ved hydrodynamisk injeksjon. Fjerning av nitisinin induserte en giftig leverskade. Immunofluorescence farging bekreftet samtidiguttrykk av FAH og GFP-L10A fusjonprotein og repopulating hepatocytter etter to uker med lever repopulation.

Den quiescent prøven produsert det høyeste utbyttet av fusjon protein, siden alle hepatocytter uttrykke GFP-L10A etter AAV8-TBG-Cre injeksjon. Omvendt var knapt noen RNA påviselig i wild-type kontroller som ikke hadde GFP-L10A transgene, noe som indikerer trap prosedyren er svært spesifikk og har lav bakgrunn. Når TRAP ble brukt på levervev gjennomgår repopulation med GFP-L10A transdusert hepatocytter, rikelig høy kvalitet RNA ble oppnådd.

I motsetning ble det ikke oppdaget RNA-spor via Bioanalyzer for den negative kontrollprøven. Gsta1-uttrykket ble indusert av over tidoblet i repopulating hepatocytter sammenlignet med quiescent hepatocytter, mens ingen terskelsyklusverdier ble oppdaget med TRAP-isolert RNA fra villtypemusen på grunn av mangel på inngang RNA. Når du homogeniserer vevet, sørg for å bevege pestle sakte for å forhindre aerasjon.

Etter å ha isolert RNA, kan høy gjennomstrømningssekvensering eller qPCR utføres for å analysere genuttrykk. Med TRAP-seq har vi nå en metode for å isolere RNA spesifikt fra å reponere hepatocytter og analysere endringen i genuttrykk under leverrebefolkning. Dette gjør at vi kan identifisere gener som endres under denne prosessen og potensielle terapeutiske mål for behandling av leverskade.

Cykloheximid og DTT, som er tilstede i flere buffere, er begge giftige. Avfall skal samles inn og kastes i henhold til institusjonelle retningslinjer.

Summary

Automatically generated

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) muliggjør rask og effektiv isolering av celle type-spesifikke oversette mRNA. Her viser vi en metode som kombinerer hydrodynamisk hale-blodåre injeksjon i en mus modell av leveren Repopulation og TRAP å undersøke uttrykket profilen til repopulating hepatocytter.

Read Article