Biology
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活细胞成像，以评估在斜接主轴扰动后元相定时和细胞命运的动态
Chapters
Summary September 20th, 2019
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在这里，我们提出一个协议，以评估主轴形成和线粒体进展的动态。我们的延时成像应用使用户能够识别线粒体不同阶段的细胞，跟踪和识别线粒体缺陷，并在接触抗线粒药物时分析主轴动力学和线粒细胞命运。
Transcript
活细胞成像可在单个细胞内观察动态细胞过程。这些方法对于评估影响细胞分裂动态过程的条件以及揭示分粒体缺陷对子细胞增殖和生存能力的影响是强大的。成像过程中光暴露导致的光毒性是与此协议相关的重大挑战。
因此，应优化曝光时间、成像间隔和持续时间。使用无菌技术和生物安全二级安全柜，使用无菌一次性玻璃巴斯德移液器从含有含有具有兴趣表达构造的细胞系的培养板中吸出介质。用10毫升无菌PBS用旋转来短暂清洗细胞，用2毫升0.05%的三辛辛对细胞进行治疗。
在37摄氏度下2至5分钟后，在板中加入8毫升新鲜介质，停止反应，用温和的移液重新暂停分离的细胞。将细胞溶液转移到无菌的15毫升管中，通过离心收集细胞。将颗粒重新在 10 毫升 PBS 中重新浓缩，然后再次使细胞离心。
将颗粒重新在10毫升的培养基中进行计数，将细胞稀释至每毫升细胞培养基浓度的1至2倍至第5细胞。然后将500微升细胞播种到无菌12井成像底板的每个井中，将该细胞放入细胞培养箱，使细胞粘附在细胞表面。成像前不超过30分钟，在一口或多口井中加入相关浓度的线粒体药物，并将抑制剂稀释剂的等量添加到与对口的相同数量的井中。
为准备成像显微镜，请将板放在装有高分辨率摄像机的倒置荧光显微镜的舞台上，将环境室预热至 37 摄氏度，并安装加湿 5%二氧化碳的输送系统。选择 20 倍空气目标，数值孔径为 0.5，并配备用于高对比度荧光和相位对比度，或明亮的场成像和查看细胞以调整过程并找到焦点以聚焦细胞。要设置亮场、GFP 和 RFP 图像采集的最佳曝光时间，请选择相应的滤波块，并为每个将成像的荧光团选择相应的激发和发射，然后单击"播放"。
如果信号不够强烈，请调整自动曝光，并在每个荧光通道中从"格式"下拉菜单中选择适当的装箱。根据制造商的说明选择显微镜阶段并校准到多孔盘，并使用图像采集软件突出显示或以其他方式选择要成像的孔。打开生成的点控制面板，在"工作区"下选择"受限"和"边界"以限制坐标选择区域以排除井的边界。
在"区域限制"下拉菜单中，选择"整个区域"并选择随机点放置。将计数设置为 6，然后单击"随机化"，分别选择每个井捕获的点的数量和分布。然后单击并在时间序列控制面板中输入值，以选择并输入收集图像的时间间隔和持续时间。
要可视化标有 RFP-H2B 的染色质，请选择用 RFP 滤波块拍摄的图像，并识别进入线粒体（如初始染色质压实和核包络分解所示）的细胞，以确定单个细胞中元相对齐和肛度发作的线粒体时间。通过采集的影片中的连续时间点跟踪感兴趣的细胞，以确定从线粒体进入到 RFP-H2B 标记的染色质在元相期间完成细胞赤道对齐的时间点数或分钟数。为了监测线粒体定时、线粒体保真度和细胞命运，请继续通过连续的时间点跟踪细胞，以确定相位染色体分离明显和/或染色质去编译和核包络改造发生的时间坐标。
然后可视化 RFP-H2B，以识别每个群体中表现出线粒体缺陷的细胞，包括在相位染色体分离期间滞后的染色体和染色质桥。通过可视化α浴缸-EGFP，可以观察到，当主轴拉对焦实现并形成双极性线粒体主轴以准备细胞分裂时，经历主轴中断的细胞会发生动态变化。与主轴组装同时，染色体运动可以通过RFP-H2B进行可视化，以评估染色体对齐和分离保真度。
利用活细胞成像方法，这些具有代表性的结果表明，具有正常中心体含量的细胞能够从核包络分解到元相对齐和离相发作，在30分钟内实现双极分裂。在额外的中体存在的情况下，近50%的细胞能够克服瞬态多极线线粒体主轴，并在完整的细胞分裂中形成双极主轴。剩余的细胞无法实现双极主轴，因此，通过多极分裂退出线粒体。
无论是否实现主轴双极性，与具有两个中体细胞的细胞相比，具有额外中体细胞的分粒期显著增加。指示线粒体进展的动态可能会改变，即使线粒体结果的变化不明显。在定义荧光通道的曝光时间时，优化曝光时间以限制光毒性。
此外，还可以选择摄像机像素装箱，以便使用更低的曝光时间。此过程适用于药理筛选、入侵和迁移分析。这些方法也可以用于检查药物治疗的疗效或细胞活动动力学的动态。
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