फ्रेट-आधारित सेंसर ATeam1.03^YEMK का उपयोग कर माउस मस्तिष्क के ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस में इंट्रासेलुलर एटीपी की इमेजिंग

यहां हम प्रदर्शित करते हैं कि ऑर्गेनोत्पिक रूप से सुसंस्कृत माउस हिप्पोकैम्पल स्लाइस में न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइटिक एटीपी स्तरों में परिवर्तन के गतिशील मापन के लिए एटीपी-संवेदनशील FRET सेंसर ATeam 1.03 YEMK को कैसे नियोजित किया जाए। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि एक नियंत्रित सेटिंग में मस्तिष्क के ऊतकों में रहने वाले ऊर्जा चयापचय का अध्ययन कर सकते हैं, उच्च सेंसर अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक वातावरण। यह तकनीक इस्कीमिक स्ट्रोक की तरह ऊर्जा अभाव के कारण, रोग, अंतर्निहित रोगों, या मस्तिष्क क्षति में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद कर सकती है।

यह सैद्धांतिक रूप से, न केवल मस्तिष्क के ऊतकों में, बल्कि अन्य अंगों में भी एटीपी स्तरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रयोग को सफलतापूर्वक चलाने के लिए, ऊतक को बेहद सावधान करने और बंध्यता बनाए रखने में शामिल सभी चरणों को करना आवश्यक है। इसके अलावा, सेलुलर फ्लोरोसेंट इमेजिंग के कुछ ज्ञान की आवश्यकता है।

सबसे परिष्कृत दृष्टिकोण में ऊतक हैंडलिंग और उचित प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक दृश्य महत्वपूर्ण है। इमेजिंग प्रयोगों के लिए भी यही सच है। प्रक्रिया का प्रदर्शन रोड्रिगो लेरचुंडी, एक पोस्टडॉक, और ना हुआंग, प्रयोगशाला से एक मास्टर छात्र होगा ।

एसीएसएफ से भरी बर्फ से ठंडी पेट्री डिश में दिमाग को फिल्टर झिल्ली पर रखें। गोलार्ध को अलग करें और 45 डिग्री के कोण पर पैरासिटामिटल कट करें। सुपरग्लू के साथ वाइब्रेटम ऊतक चरण में एक गोलार्द्ध को ठीक करें, और तुरंत ऊतक ब्लॉक को वाइब्रेटोम बाथ में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ-ठंडे ACSF 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% ऑक्सीजन के साथ बुलबुला होता है।

वाइब्रेटम बाथ में टिश्यू को संरेखित करें। टुकड़ा करने की क्रिया तक बर्फ-ठंडे ACSF में दूसरा गोलार्द्ध रखें। 250 से 400 माइक्रोमीटर पर स्लाइस काटने के लिए वाइब्रेटोम को समायोजित करें।

स्लाइस काटने के बाद, अपने विशिष्ट रूपात्मक उपस्थिति के आधार पर हिप्पोकैम्पस गठन की पहचान करें और हिप्पोकैम्पस से सटे सेरेब्रल कॉर्टेक्स के हिस्से को रखते हुए हाइपोडर्मिक सुइयों का उपयोग करके इसे अलग करें। ACSF में एक जाल पर टुकड़ा प्लेस, ३४ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम और 5% कार्बन डाइऑक्साइड और ९५% ऑक्सीजन के साथ बुलबुला जब तक सभी स्लाइस एकत्र कर रहे हैं । स्लाइस को बाँझ परिस्थितियों में जारी रखने के लिए लेमिनार प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें।

एक उल्टे, बाँझ, ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ, धीरे-धीरे एसीएसएफ से स्लाइस को बाँझ हैंक्स नमक समाधान से भरे पूर्व-गर्म पेट्री व्यंजनों में से एक में स्थानांतरित करें। पिपेट बदलें और स्लाइस को दूसरी संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया को कुल मिलाकर पांच बार दोहराएं।

निम्नलिखित संस्कृति प्लेटों के लिए संभव के रूप में छोटे एचबीएस के रूप में स्थानांतरित करें। एक पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे संस्कृति डालने के शीर्ष पर एक समय में एक टुकड़ा रखें। पिपेट में अशांति से बचें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि टुकड़ा पाश्चर पिपेट की नोक पर न उतर जाए।

प्रत्येक स्लाइस के लिए प्रक्रिया दोहराएं। एक झिल्ली पर दो स्लाइस रखें। एक ठीक टिप का उपयोग करके डालने के ऊपर से किसी भी अतिरिक्त हांक समाधान को ध्यान से हटा दें।

प्रयोग के दिन तक संस्कृतियों को 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में रखें। हर दो से तीन दिन में मीडियम बदलें। ऊतक को छूने के बिना, प्रत्येक स्लाइस के शीर्ष पर सीधे पतला वेक्टर के 0.5 माइक्रोलीटर लागू करें।

अंत में, स्लाइस को इनक्यूबेटर में वापस रखें और उन्हें कम से कम छह दिनों तक बनाए रखें। एक प्रयोग शुरू करने से ठीक पहले, बाँझ हुड में सुसंस्कृत स्लाइस युक्त एक डालें स्थानांतरित करें, और इसे ऑर्गॉयपिक स्लाइस संस्कृति माध्यम, या न्यूनतम आवश्यक माध्यम के एक मिलीलीटर वाले 30 मिलीमीटर पकवान में रखें। स्टीरियोस्कोप के नीचे पकवान रखें और टुकड़ा की सतह पर ध्यान केंद्रित करें।

एक चुने हुए टुकड़े के संकीर्ण किनारों पर एक छोटी क्रॉस-कट बनाने के लिए दो बाँझ हाइपोडर्मिक सुइयों का उपयोग करें, और ऊपरी परत में नीचे ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना। डालने से तैयार टुकड़ा को हटाने के लिए, चिमटी के साथ झिल्ली के किनारों को पकड़ें और झिल्ली में सीधे, समानांतर कटौती करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें, केंद्र में टुकड़ा के साथ एक वर्ग या त्रिकोण बनाते हैं। यदि सम्मिलित अतिरिक्त स्लाइस होस्ट करता है, तो इसे मूल प्लेट में और इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।

माध्यम की सतह तनाव झिल्ली की सतह पर इसके रिसाव को रोक देगा। प्रायोगिक ACSF तैयार करें और कम से कम तीस मिनट के लिए कार्बोजन आपूर्ति से जुड़े एक डाला ट्यूबिंग के माध्यम से 95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इसे बुदबुदाने द्वारा 7.4 का पीएच प्राप्त करें। पूरे प्रयोग के दौरान खारा बुलबुला रखें।

फिर मोनोक्रोमेटर के फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत पर स्विच करें। ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस कल्चर को प्रायोगिक कक्ष में स्थानांतरित करें। फ्रेम के साथ ऑर्गॉयपिक स्लाइस संस्कृति के शीर्ष पर एक ग्रिड रखें, संस्कृति को छू नहीं, और धागे ऊपर, झिल्ली को छूते हैं।

चैंबर को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और परफ्यूजन सिस्टम से कनेक्ट करें। प्रति मिनट 1.5 से 2.5 मिलीलीटर की प्रवाह दर पर पेरिस्टाल्टिक पंप पर स्विच करें। सुनिश्चित करें कि पर्फ्यूजन सिस्टम का कोई रिसाव नहीं है।

ट्रांसमिशन लाइट का उपयोग करके, सुसंस्कृत स्लाइस को ध्यान में लाएं और उस क्षेत्र की पहचान करें जहां प्रयोग किए जाएंगे। इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले, स्लाइस को नमकीन स्थितियों के अनुकूल बनाने की अनुमति देने के लिए कम से कम 15 मिनट इंतजार करें, फिर कैमरे और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर स्विच करें। 435 नैनोमीटर पर दाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजित करें।

एक्सपोजर समय 40 से 90 मिलीसेकंड के बीच सेट करें। इसके बाद डिक्रोनिक मिरर और फिल्टर्स को बीम स्प्लिटर यूनिट में डालें। एक उत्सर्जन छवि स्प्लिटर के साथ 500 नैनोमीटर पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को विभाजित करें, और दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरेसेंस को अलग करने के लिए 482 प्लस या माइनस 16 और 542 प्लस या माइनस 13.5 नैनोमीटर पर बैंड पास फिल्टर को नियोजित करें।

पृष्ठभूमि घटाव के लिए सेलुलर फ्लोरेसेंस से रहित ब्याज के क्षेत्र का चयन करें। आरओआई बनाने के लिए स्क्रीन पर छवि में लेबल किए गए ऊतकों की एकल संरचनाओं को सर्कल करें। छवि अधिग्रहण की आवृत्ति और समग्र रिकॉर्डिंग समय निर्धारित करें।

30 मिनट से अधिक समय तक के प्रयोगों के लिए, फोटोटोक्सीसिटी को रोकने के लिए 0.2 से 0.5 हर्ट्ज की अधिग्रहण आवृत्ति की सिफारिश की जाती है। बाद में, रिकॉर्डिंग शुरू करें। इंट्रासेलुलर एटीपी में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए, पर्फ्यूजन ट्यूब को मानक ACSF से मेटाबोलिक अवरोधकों युक्त खारा में स्विच करें, उदाहरण के लिए, रासायनिक इस्केमिया समाधान।

वैकल्पिक रूप से, सक्रिय न्यूरॉन्स से पोटेशियम आयन की रिहाई की नकल करने के लिए आठ मिलीमोलर पर ऊंचा पोटेशियम एकाग्रता के साथ एक खारा का उपयोग करें। रिकॉर्डिंग के बाद सीधे, प्रयोगात्मक ACSF को ढेर-बफर ACSF के साथ एक्सचेंज करें। फिर स्लाइस संस्कृति वाले रिकॉर्डिंग कक्ष को कॉन्फोकल लेजर स्कैन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें।

दिए गए ऑप्टिकल विन्यास पर संभव उच्चतम जेड संकल्प पर जेड स्टैक छवियों ले लो। इस प्रोटोकॉल में, एक ट्रांसडक्शन के दस दिन बाद, एक टीम 1.03 YEMK व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स स्लाइस सतह के नीचे 50 माइक्रोमीटर तक की गहराई में सुसंस्कृत ऊतक स्लाइस के नियोकॉर्टेक्स में उच्च घनत्व में पाए गए। हिप्पोकैम्पस में तुलनीय परिणाम प्राप्त किए गए।

एस्ट्रोसाइट्स के लिए, एटीम 1.03 YEMK मानव ग्लियल फाइब्रोलरी अम्लीय प्रोटीन प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया गया था, और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स चयनित आरओआई में ATeam 1.03 YEMK व्यक्त करने वाले ऑर्गेनोटिक स्लाइस पिरामिड कोशिकाओं की सोमाता का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक मिनट के लिए बाहुलर ग्लूकोज की अनुपस्थिति में 5 मिलीमोलर सोडियम एजाइड के स्लाइस को उजागर करने के बाद, FRET जोड़ी के उत्सर्जन तीव्रता में विपरीत परिवर्तन प्रेरित किए गए थे। ATeam FRET अनुपात में एक रिवर्सिबल कमी भी देखी गई।

न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स में बेसलाइन स्थितियों के तहत 14 विभिन्न कोशिकाओं में दीर्घकालिक ATeam FRET अनुपात से पता चलता है कि ATeam एक विश्वसनीय और स्थिर सेंसर है । कृपया ध्यान दें कि रासायनिक इस्केमिया के परिणामस्वरूप इस प्रयोग के अंत में दोनों सेल प्रकारों में ATeam अनुपात में संभावित मजबूत गिरावट हुई। तीन मिनट के लिए तीन से आठ मिलीमोलर तक बाह्य मात्रा में वृद्धि के परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स में एक टीम 1.03 YEMK व्यक्त करने वाले एक पता लगाने योग्य परिवर्तन नहीं हुआ।

इसके विपरीत, एस्ट्रोसाइट्स ने एकम FRET अनुपात में प्रतिवर्ती वृद्धि द्वारा बाह्य पोटेशियम में वृद्धि पर प्रतिक्रिया व्यक्त की, जो इंट्रासेलुलर एटीपी स्तरों में वृद्धि का संकेत है। फिर, रासायनिक इस्केमिया ने एटीएम अनुपात में तत्काल कमी का कारण बना, यह प्रदर्शित करते हुए कि सेंसर एटीपी में परिवर्तन का पता लगा सकता है। यहां वर्णित FRET-आधारित सेलुलर इमेजिंग का प्रयास करते समय, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि ऑर्गेनोटिपिक संस्कृतियों में उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस का उत्पादन एक महत्वपूर्ण कदम है।

इसके अलावा, ग्लियल निशान और विशेषज्ञ स्तर इमेजिंग को सावधानीपूर्वक हटाने की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया के बाद, सेलुलर मेटाबोलाइट्स के लिए विभिन्न अन्य FRET-आधारित नैनोसेंसर को शामिल करते हुए प्रयोग करने में भी सक्षम होना चाहिए। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज या लैक्टेट के लिए वे।

अंत में, लेकिन कम नहीं, इस बात पर जोर देने की जरूरत है कि पशुओं की सुरक्षा के लिए प्रासंगिक कृत्यों को हमेशा देखा जाना चाहिए । यह आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों की हैंडलिंग को नियंत्रित करने वाले प्रभावी कानूनों के लिए भी सही है।