Bioengineering
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ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片
Chapters
Summary February 10th, 2020
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食道再建は困難な処置であり、食道粘膜や筋肉の再生を可能にし、人工移植として移植できる組織工学的食道の開発が必要である。ここでは、足場製造、バイオリアクター栽培、各種外科技術など、人工食道を生成するためのプロトコルを紹介します。
Transcript
経周食道修復は、ラットモデルでは技術的に困難であり、食道吻合筋漏れのない食道粘膜や筋肉の再生を可能にする組織操作食道の開発が必要です。移植後の唾液漏れを最小限に抑えるために、内ナノファイバーと外側3Dプリンティングストランドを組み合わせて、2層状の管状足場をパイロットモデルとして実装しました。従来の標準的食道再建は、広範囲の合併症および罹患率に関連している。
したがって、食道組織工学は、ネイティブの患者食道モデルを開発するための有望な代替戦略である可能性があります。ハイブリッド足場、バイオリアクター栽培、および経口栄養システムの組み合わせは、その連続的な機械的圧力と同様の汚染された環境を有する任意のシステムに適用することができる。まず、紫外線への1時間の暴露、エタノールへの10分間の浸漬、PBSでの3回のスケッシュで3Dプリント食道足場を殺菌することから始めます。
最後の洗浄の後、2層状の管状足場を非接着型の24ウェル組織培養プレートに入れ、足場の内面に成長培地を加えた基基膜マトリックスのミリリットル当たり6つの脂肪由来ヒト間葉幹細胞に10回10回を加える。細胞種管状足場をバイオリアクターの培養室のアクリルホルダーにしっかりと固定し、500ミリリットルの成長培地をチャンバーに加えるために、脈動性流動バイオリアクターシステムを使用します。次に、5%の二酸化炭素を含む湿気のある雰囲気下で、流れ誘発せん断応力の1センチメートル/1ダインを適用する。
5日後、LIVE/DEAD Viabilityアッセイキットを使用して、標準的なプロトコルに従って足場の内面の細胞応答を決定し、共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。手術を開始する前に、麻酔ラットのペダル反射に対する応答の欠如を確認し、動物を無菌ドレープの上のスペイン位置に置きます。バリカンを使用して外科部位から毛髪を取り除き、露出した皮膚をシーケンシャルΒDINEおよび70%エタノールスクラブで消毒する。
Tチューブの配置のために、ラットの腹部に中線の皮膚と筋肉の切開を行い、メスの刃を使用して前胃壁に3ミリメートルのオリフィスを作成します。シリコーンTチューブの先端を欠損部位に挿入して胃壁に固定し、チューブを胃筋組織に慎重に縫合します。腹壁を4-0 VICRYL縫合で縫合する。
慎重に首の後ろに皮下トンネルを通って埋め込まれたTチューブの遠位端を挿入し、血管カテーテルを使用してヘパリンキャップをTチューブの端に接続して、胃の内容物が後方に流れないようにします。キャップが所定の位置にある場合は、4-0ポリグラクチン縫合糸を使用して腹部の皮膚のすべての層を閉じ、完全な再発まで監視してラットを代謝ケージに入れます。Tチューブの配置の1週間後に、デモンストレーションのようにラットを手術用に準備する。
ラットを顕微鏡下に置き、露出した感染した皮膚に前中央分離帯の頸部切開を行う。ストラップの筋肉を分離して気管食道構造を露出させます。食道の左側を気管から分離します。
食道の上部を甲状腺から慎重に分離し、手術用はさみを使用して、食道のすべての層を含む5ミリメートルの全周欠損を作成する。次に、上部食道残骸と足場の右下垂部マージンと足場の間に9-0の縫合糸を挿入し、上食道残骸と足場の間で右から左に縫合を続け、遠位食道欠損の上端に微小吻合を作り出す。次に、下食道残骸の上マージンと同様にして足場を吻合する。
アナストモーゼが完成したら、移植部位の上に周囲の甲状腺フラップを置き、移植片への血管供給と安定した維持を確保する。次に、皮下筋と皮膚組織を4-0 VICRYL縫合糸で縫い合わせ、完全な再発までモニタリングを行う赤外線ウォーミングデバイス上の代謝ケージにラットを入れます。注入によって足場の内壁に均等に適用した後、ヒト間葉系幹細胞埋め込み基質マトリックスは、走査型電子顕微鏡法で評価される予想される間葉系幹細胞形態を示す。
示されているように完全な周回食道欠損を有するラットへの食道移植後、移植片は、移植部位への安定した固定および血管供給のために甲状腺フラップで覆われる。食道移植ラットは処置後約9日まで340グラムのままで、その時点で動物は様々な原因のために体重が急速に減少し、15日目までに死亡する。ほとんどのラットは毛玉によって引き起こされる非食道閉塞を発症するが、全体的に穿孔、瘻孔による吻合漏れ、精巣の蓄積、膿瘍形成、または周囲の軟部組織壊死の総証拠はない。
移植部位の再上皮化はケラチンの免疫蛍光染色によって確認でき、再生コラーゲン層とエラスチン繊維はマッソンのトリクローム染色によって明確に観察することができる。食道筋層の再生は、デスミン免疫体系化学分析によって評価される豊富な新生血管化によっても証明される。この手順の成功は、食道再建中に栄養を提供するために首の後ろの固定を介してTチューブの安定した維持に依存しています。
この手順に典型的な初期死亡率を克服するために、臓器不同または早期血管化技術を食道移植後に適用して、機能的食道再建を助けることができる。
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