Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Neuroscience

Märkning och avbildning av amyloida plack i hjärnvävnad med hjälp av naturliga polyfenol Curcumin

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Journal (Neuroscience)

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Journal (Neuroscience)

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Click here for the English version

Märkning och avbildning av amyloida plack i hjärnvävnad med hjälp av naturliga polyfenol Curcumin

Article DOI: 10.3791/60377-v

November 1st, 2019 •

Panchanan Maiti^1,2,3,4,5, Alexandra Plemmons¹, Zackary Bowers^2,3, Charles Weaver⁵, Gary Dunbar^1,2,3,4

¹Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, ²Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, ³Program in Neuroscience, Central Michigan University, ⁴Department of Psychology, Central Michigan University, ⁵Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 1st, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Curcumin är en idealisk fluorophore för märkning och avbildning av amyloid beta protein plack i hjärnvävnad på grund av dess preferens bindning till amyloid beta protein samt dess strukturella likheter med andra traditionella amyloid bindande färgämnen. Det kan användas för att märka och avbilda amyloid beta protein plack mer effektivt och billigt än traditionella metoder.

Transcript

Detta protokoll är den mest effektiva och kostnadseffektiva metoden för att exakt märka beta-amyloid plack, jämfört med amyloid-specifika antikroppar, som för närvarande är guldmyntfoten för märkning av dessa plack. Denna teknik tar mindre tid och är lika effektiv som någon av de vanligen använda amyloid märkning metoder. Curcumin binder starkt till amyloidplack och kan användas som en avbildningssond under PET-skanningar av hjärnan och för relativt noninvasiva screenings med hjälp av näthinneskanning.

Curcumin binder också till neurofibrillary eller tau tangle vid Alzheimers sjukdom, alfasynuclein vid Parkinsons sjukdom och mutanta Huntingtons proteiner vid Huntingtons sjukdom. Demonstrera förfarandet med Panchanan Maiti kommer att Zackary Bowers, en doktorand, och Alexandra Plemmons, en forskare från mitt labb. Efter att ha bekräftat en brist på svar på smärta reflex i en sövd 12 månader gammal Alzheimers sjukdom modell mus, placera musen i ryggläge på en operation bricka och göra ett snitt i buken och genom membranet.

Sätt in en 21 gauge perfusionsnål i snittet och gör ett litet snitt vid höger auricle så att perfusionsvätskan kan rinna av från kroppen. Använd ett gravitationsmatat perfusionssystem för att låta iskall 0,1 molar PBS-vätska flöda in i nålen i fem till sex minuter vid en 20 till 25 milliliter per minut flödeshastighet. Om perfusionen utförs korrekt kommer en klar lever att observeras.

En korrekt djurperfusion är väsentlig för om blodet inte avlägsnas helt, kan curcumin binda till blodkärlen och resultera i en grön fluorescerande bakgrundssignal. När alla PBS har levererats, växla buffertventilen till en iskall 4%paraformaldehyd lösning i åtta till 10 minuter innan du använder sax och tlyktor för att frigöra hjärnan från skallen. Använd sedan en spatel för att placera hjärnan i en injektionsflaska med 4%paraformaldehyd minst 10 gånger vävnadsvolymen för fyra grader celsius lagring tills bearbetning.

För att erhålla sektioner för kryostatsektioner, sekventiellt fördjupa hjärnan i graderade sackaroslösningar vid fyra grader celsius i 24 timmar per koncentration innan du använder en kryostat vid negativ 22 grader celsius för att erhålla 40 mikrometersektioner, placera 10 till 20 sektioner per brunn i en sex brunnsplatta som innehåller PBS kompletterat med 0,02%azide när de erhålls. När alla prover har förvärvats, lagra sektionerna på fyra grader celsius tills vidare bearbetning. För att erhålla sektioner för paraffinsektionering, dehydrera efterspäckade perfused hjärnvävnad med sekventiella graderade alkohollösningar för två timmar per koncentration, följt av två en timme 100%alkohol nedsänkningar och två en timme xylen nedsänkningar vid rumstemperatur.

Efter den sista xylen nedsänkning, penetrera vävnaden med en en till en xylen till paraffinlösning två gånger under en timme per inkubation vid 56 grader celsius i ett glas koniskt glas täckt med aluminiumfolie innan du fördjupa vävnaderna i 56 grader celsius paraffin i fyra till sex timmar. I slutet av inkubationen, använd en roterande mikrotom vid rumstemperatur för att få fem mikrometer tjocka sektioner placera sektionerna i en 45 grader celsius vävnad vattenbad som de samlas. För curcumin märkning av amyloid beta plack i cryostat vävnad sektioner, skölj sektionerna med PBS tre gånger i fem minuter per tvätt innan dukar ner sektionerna i 70%etanol i två minuter vid rumstemperatur.

Medan sektionerna inkuberar, lös en millimolar av lager curcumin i metanol och späd lösningen till en slutlig arbetskoncentration på 10 mikromolar med 70%etanol. Vid inkuberingens, sänk sektionerna i arbetskurkuminlösningen i 10 minuter vid rumstemperatur vid 50 rotationer per minut. Vid slutet av färgningsperioden, kassera curcuminlösningen och tvätta sektionerna med tre två minuters tvättar i 70%etanol.

Efter den sista tvätten, överför sektionerna till polylysinbelagda glas och montera en täckglid på varje rutschkana med ett lämpligt organiskt monteringsmedium. Visa sedan avsnitten på ett florescencemikroskop med hjälp av ett 10 eller 20x-mål och lämpliga excitations- och utsläppsfilter. För histochemical märkning av djupa paraffinerade vävnad sektioner, sänk de fem mikrometer tjocka sektionerna i xylen två gånger i fem minuter vid rumstemperatur per nedsänkning, följt av rehydrering med graderade en minut alkohollösning nedsänkningar.

Vid slutet av inkubationen tvättar du sektionerna med graderade alkohollösningar i två minuter per koncentration följt av röjning med två fem minuters xylensänkning. Efter den andra xylen nedsänkning, montera varje avsnitt på ett mikroskop glida med ett lock slip och en lämplig monteringsmedium för florescence mikroskopi imaging som visats. För märkning av kryostatsektionsprover med anti-A-beta-antikroppar, tvätta proverna tre gånger med färsk PBS per tvätt i enskilda brunnar med en 12 brunnsplatta innan du blockerar någon icke-specifik bindning med 10%normal getserum i PBS och 0,5%triton x-100 i en timme vid rumstemperatur.

Vid slutet av inkubationen kasserar du blockeringslösningen och inkuberar proverna med a-betaspecifik antikropp över natten med fyra grader celsius och 150 rotationer per minut. Nästa morgon, tvätta sektionerna med tre 10 minuters tvättar i färska PBS per tvätt, följt av inkubation med en lämplig sekundär antikropp konjugerad med en röd fluorofore i en timme vid rumstemperatur skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen tvättar du sektionerna tre gånger med PBS följt av en tvätt med 70%alkohol.

Efter alkoholtvätten, inkubera sektionerna med 10 mikromolar curcumin i 10 minuter vid rumstemperatur följt av tre en minut 70%alkohol tvättar. Efter den sista tvätten, dehydrera sektionerna med 90%och 100%alkohol i en minut per koncentration och rensa sektionerna två gånger i fem minuter per nedsänkning med färsk xylen per inkubation. Montera och avbilda sedan avsnitten som demonstrerade.

För intracellulära amyloid beta co-lokalisering, fläck sektionerna med anti amyloid beta antikropp följt av färgning med curcumin vid rumstemperatur och 50 rotationer per minut skyddas från ljus som visats. Vid inkuberingens, räknaren med ett lämpligt kärnämne i 10 minuter vid rumstemperatur och 50 rotationer per minut som skyddas mot ljus följt av tre tvättar i PBS. Montera och avbilda sedan sektionerna genom fluorescensmikroskopi som visats.

Även om en ökning av inkubationstiden med curcumin något ökar fluorescensintensiteten hos A-betaplacken, skiljer sig inte antalet observerade plack signifikant mellan en och fem minuters färgningstid. Curcumin kan användas för att färga En beta plack och kryosektionerade, paraffin inbäddade, och mänskliga Alzheimers sjukdom vävnadsprover. Märkning med En betaspecifik antikropp före curcuminfärgning avslöjar att curcumin är helt samlokaliserad med A beta vid samma plack som binder antikroppen.

Efter färgning med curcumin märkt A beta oligomerer, curcumin co-lokalisering med de oligomerer kan observeras i A beta plack. På samma sätt samlokaliserar curcumin också med A-beta-specifika antikroppen i intracellulära utrymmen, vilket bekräftar att fläcken kan märka intracellulär A-beta. Curcumin märkning är också mer framträdande än konventionella amyloid bindande färgämnen.

Curcumin derivat som finns i tumeric extrakt etikett A beta plack jämförelsevis att curcumin i mänskliga Alzheimers sjukdom hjärnvävnad oavsett vilken typ av montering medium som används. Dessutom, curcumin immunofluorescens signaler och counterstaining intensitet bibehålls även efter färgning med typiska nukleära fläckar och andra cellmarkörer. Vi mötte att konstanta sektioner ska vara tunnare än 40 mikrometer.

Denna utbildning förfarande bör hållas under 30 minuter och den optimala curcumin koncentrationen är en till två mikromolar. Dubbla utjämnings efterblivna biomarkörer kan utföras på samma vävnad och kan ge en större specificitet av vilka typer av hjärnceller som utjämnas. Med tanke på att curcumin kan minska amyloid plack belastningen, de exakta mekanismerna för hur denna process sker är för närvarande undersöks på både cellulära och molekylära nivåer.

X

Simple Hit Counter