Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En tuberkulos molekylär bakteriell belastning analys (TB-MBLA)
Chapters
Summary April 30th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en tuberkulos molekylära bakteriella belastningsanalys test utförs efter värme inaktivering av sputum. Värmeinaktivering gör sputumprover icke-infektiösa och undanröjer behovet av inneslutningsnivå 3 laboratorier för tuberkulos molekylära tester.
Transcript
Denna tuberkulos molekylära bakteriell analys, svarar på tre viktiga frågor. Ett:Vad är omfattningen av patientens sjukdomsbörda? Två:Hur svarar patientsjukdomsbördan på anti-tuberkulosmedicinen?
Och tre:Vad är sambandet mellan sjukdomsbörda och behandlingssvar? Denna analys ger ett kvantitativt resultat av patientens tuberkulos börda, och mäter hur denna börda förändras med behandling på kort tid. Med modifiering kan denna metod tillämpas på andra bakteriella patogener.
Vi har redan utvecklat liknande teknik för diagnos av nontuberculous mykobakterier, och bakterier som är associerade med kronisk obstruktiv lungsjukdom. När du utför den här tekniken för första gången tittar du på videon och övar på stegen. Det är mycket viktigt att öva med prover som inte behövs för patientens diagnostiska resultat.
Visuell demonstration är avgörande eftersom det förenklar inlärning och mastering av steg, särskilt de delar av metoden som är svåra att förklara i text. Börja med att förbereda cellkulturerna. På en ren labbbänk eller klass en stuga, skörda en milliliter alikvoter av exponentiell fas Bacille Calmette-Guerin eller BCG kultur i 15 milliliter plaströr och tätt stänga dem.
Vid beredning av patientens sputumprover, arbeta i ett väl ventilerat utrymme och följ riktlinjerna i GL One Stop TB handbok. Öppna försiktigt provexemplarets kopp och pipettera en milliliter alikvoter i 15 milliliter plastcentrifugrör. Stäng sedan tätt tuberna.
Överför provrören till ett holdingställ nedsänkt i ett vattenbad som förvärms till 95 grader Celsius, se till att 3/4 av varje rör sänks ned. Koka proverna i 20 minuter. Sedan, överför rören till bänken för att svalna i rumstemperatur i fem minuter.
Utför RNA-utvinning i en rökhuv om du använder ett kit med fenolklorform eller tumörkapitaletol. RNA-förfarandet som illustreras här är fenol kloroform extraktionsproceduren. Alternativa metoder för RNA-extraktion får dock också användas.
Överför en milliliter alikvoter av det värme inaktiverade provet till 1,5 milliliterrör och spik 100 mikroliter av extraktionskontroll i varje prov. Stäng rören och blanda dem genom att vända in. Centrifugera rören vid 20, 000 gånger g i 10 minuter.
Sedan aspirera supernatanten och lämnar 50 mikroliter sediment. Vi suspender sedimentet i 950 mikroliter lysbuffert genom pipettering och överför hela suspensionen till de lysningsmatrisrör som medföljer RNA-extraktionssatsen. Tätt stäng rören och se till att de är märkta på både locket och sidan.
Sedan homogenisera proverna i 40 sekunder vid 6, 000 rpm. Centrifugera lysate vid 12, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Under tiden, förbereda färska en milliliter rör, och tillsätt 300 mikroliter kloroform.
Använd en en milliliterpipett för att försiktigt aspirera supernatanten utan att vidröra lysningsmatrisen och för över den till röret med kloroformen. Vortexa rören i fem sekunder och låt dem nöja sig med fem minuter eller tills tre faser är väl synliga. Centrifugera rören vid 12, 000 gånger g i fem minuter.
Sedan, försiktigt pipettera den övre fasen och överföra den till en 1,5 milliliter rör. Tillsätt 500 mikroliter iskall 100%etanol till provet, stäng röret, och invertera det tre gånger för att blanda. Inkubera rören vid minus 80 grader Celsius i 15 minuter eller vid minus 20 grader Celsius i 30 minuter.
Sedan, ladda rören i en pre-kyld mikrocentrifug och centrifug i 20 minuter vid 13, 000 gånger g och fyra grader Celsius. Kassera supernatanten, tillsätt 500 mikroliter av 70%iskall etanol och centrifug i ytterligare 10 minuter vid 13, 000 gånger g. Kasta alla supernatant.
Och inkubera rören vid 50 grader Celsius i 20 minuter för att torka nukleinsyra pelleten, se till att hålla rören delvis öppna för att möjliggöra avdunstning av etanol. Därefter tillsätt 100 mikroliter kärnfri vatten till pelleten och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Vortexa provet i tre sekunder och fortsätt med DNA-avlägsnande eller lagra den på minus 80 grader Celsius tills den är klar att användas.
Beredd DNA:s enmix enligt manuskriptriktningarna och pipetten 11 mikroliter i varje rör som innehåller RNA-extrakt. Vortexa i tre sekunder och snurra ner kort för att ta bort eventuella droppar från väggen i röret. Sedan, inkubera röret vid 37 grader Celsius i 30 minuter i varmblocket eller inkubatorn.
Efter inkubationen, tillsätt ytterligare en mikroliter av DNA: s ett enzym direkt till röret, och blanda väl genom att virvla. Sedan, inkubera rören i ytterligare 30 minuter vid 37 grader Celsius. Tina och vortexa DNA:s inaktiveringsreagens.
Lägg sedan till 10 mikroliter till varje RNA-extrakt. Och inkubera rören i rumstemperatur i fem minuter. Vortexa rören tre gånger under inkubationssteget.
Sedan centrifug blandningen vid 13, 000 gånger g i två minuter och försiktigt överföra supernatanten till en 1,5 milliliter RNA: s fria rör, se till att inte röra någon av inaktivering matris. Späd alla okända RNA prover en till 10 i RNA: s fria vatten sedan, blanda dem genom att virvla i fem sekunder och kort snurra ner dem. Thaw MTB och EC-RNA prover och att göra sju respektive sex tiofaldiga utspädningar för en standardkurva.
Förbered RT plus och RT minus PCR master mixar enligt manuskriptet riktningar. Vortexa RT plus blanda och överföra 16 mikroliter i varje RT plus PCR-rör. Sedan, virvel RT minus mix och lägga till 16 mikroliter i varje RT minus PCR-röret.
Tillsätt fyra mikroliter RNA-extrakt eller vatten och duplicera till RT plus-rören. Vattnet är den icke-mall kontroll eller NTC. Tillsätt fyra mikroliter RNA-extrakt eller vatten till RT minusrören.
Ladda in reaktionsrören i realtids-PCR-maskinen, programmera reaktionen enligt beskrivningen i manuskriptet och kör reaktionen. För att tolka behandlingssvaret, använd standardkurvan för att omvandla CQ-värden till bakteriebelastning och beräkna svaret som förändringen av bakteriebelastningen under behandlingsuppföljningsperioden. Nedgången i bakteriebelastningen efter behandling innebär ett positivt svar medan ingen förändring eller ökning av bakteriebelastning innebär ett negativt svar.
För att kontrollera att alla M.tuberculosis bacilli var värme inaktiveras, optisk densitet av cellerna mättes och jämfört med den i levande celler. Ingen förändring av OD över tiden observerades för de värme inaktiverade proverna som inte visade på någon tillväxt. Värme inaktiverade prover inkuberades vid 37 grader Celsius för att avgöra om RNA bryts ned efter värmeinaktivering av celler.
Ingen skillnad hittades mellan RNA skördas omedelbart efter värme inaktivering, och RNA isolerade en, två, tre och fyra dagar senare i både BCG kulturer och TB positiva sputum. När RNA:s A-enzym exogent tillsattes i proverna, före och efter värmeinaktivering, inträffade RNA-förlust i alla värme inaktiverade prover under fyra dagars inkubation. Effekten av värme inaktivering på ribosomala RNA mättes i BCG kulturer och sputum från TB positiva patienter.
Den uppmätta bakteriebelastningen av kontrollodling var högre än den kombinerade bakteriebelastningen av värme inaktiverad kultur vid 80 grader Celsius, 85 grader Celsius och 95 grader Celsius för både BCG och sputumprover. Värme inaktivering av proverna orsakar minimal förlust av RNA, lämnar adekvat RNA för nedströms TB-MBLA och andra nedströms molekylära tester. Transmission Electron Microscopy användes för att undersöka om celler som lysts av värme inaktivering.
Inspektion av cellerna vid lägre och högre förstoring avslöjade intakt cellväggarna och de synliga intracellulära lipidkropparna. Cellerna verkade långsträckta, men inte lysed. När du försöker den här proceduren är det viktigt att komma ihåg att lägga till extraheringskontrollen, som styr för eventuella falska negativa resultat på grund av dålig RNA-utvinning.
Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på bakterier som är associerade med kronisk obstruktiv lungsjukdom, nontuberculous mykobakterier infektion och andra luftvägarna patogener. De kvantitativa resultaten från TB-MBLA har möjliggjort matematisk och farmako-modellering av hur patienter svarar på en tuberkulosbehandling. Vi ser fram emot att tillämpa tekniken i rutinvård där tuberkulospatienter hanteras.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
