Cancer Research
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Culture, Manipulation et Transplantation orthotopique d'organoïdes tumoraux de la vessie de souris
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Summary January 31st, 2020
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Ce protocole fournit des étapes expérimentales détaillées pour établir une culture in vitro tridimensionnelle des organoïdes de tumeur de réservoir souple dérivés du cancer de réservoir souple cancérogène-induit. Des méthodes de culture comprenant le passage, le génie génétique, et la transplantation orthotopic des organoïdes de tumeur sont décrites.
Transcript
Organoïdes tumoraux ont été largement utilisés comme un modèle de cancer in vitro pour étudier la biologie tumorale. Notre protocole fournit une procédure détaillée pour isoler, culture, et manipuler génétiquement organoïdes de tumeur de réservoir souple servant d’outil critique pour étudier divers aspects dans la biologie de cancer. En utilisant notre protocole, nous pouvons manipuler génétiquement les organoïdes tumoraux de la vessie pour exprimer ou assommer le gène de notre intérêt.
En outre, avec notre méthode orthotopique de transplantation, nous pouvons créer un organoïde intact de tumeur de tumeur. Yubin Kim, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par établir des organoïdes de tumeur de réservoir souple de la tumeur de réservoir souple de murine.
Ajouter un millilitre de HEPES de 10 millimlaires dans le DMEM aux fragments tumoraux et hacher le tissu à l’aide d’une lame de rasoir stérilisée. Pour dissocier les fragments en suspension cellulaire, ajouter neuf millilitres de DMEM avec HEPES, collagène de type un et deux, et thermolysine aux morceaux de tumeur, et les incuber pendant 1,5 à deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone sur un shaker orbital. Après l’incubation, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres.
Centrifugez le tube à 400 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirez le supernatant. Resuspendez la pastille en cinq millilitres de tampon de lysage ACK et incubez le tube à température ambiante pendant trois à cinq minutes pour lyser les globules rouges. Pendant ce temps, enrober un puits d’une plaque de 24 puits de 150 microlitres de facteur de croissance du froid glacé réduit la matrice membranaire du sous-sol et placer la plaque dans un incubateur pendant 30 minutes.
Ajouter 20 millilitres de DMEM dans le tube avec les cellules et répéter la centrifugation. Aspirez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de 0,25% trypsine EDTA et 10 micromolaire Y-27632 dihydrochlorure. Incuber le tube pendant cinq minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.
Neutralisez ensuite la trypsine en ajoutant 10 millilitres de DMEM avec 10% de FBS. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres sur un nouveau tube de 50 millilitres pour enlever les débris non digérés. Centrifugez le tube à 400 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirez le supernatant.
Puis résuspendez la pastille avec un millilitre de DMEM et comptez les cellules avec un hémocytomètre. Transférer trois à quatre fois 10 dans les quatre cellules tumorales sur un microtube de 1,5 millilitre sur la glace et le centrifuger à 400 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez les cellules dans 500 microlitres de milieu organoïde préchauré et 10 micromolaire y-27632.
Transférez la suspension cellulaire dans la matrice membranaire précédemment préparée bien enduire et placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur. Remplacer le milieu tous les deux jours par 500 microlitres de milieu organoïde préchauré. Divisez les organoïdes tumoraux 12 heures avant la transduction médiée par le lentivirus.
Le lendemain, décongelez rapidement un virus contenant de l’aliquot dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ajouter le virus décongelé à 250 microlitres de milieu organoïde avec 10 micromolaires Y-27632 et huit microgrammes par millilitre de bromure d’hexadiméthrine. Remplacer le milieu organoïde dans la plaque de 24 puits par 500 microlitres du virus contenant moyen et incuber la plaque pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour préparer les organoïdes tumoraux de la vessie pour la transplantation orthotopique, ajouter 500 microlitres de collagène dispase au milieu organoïde dans la plaque de 24 puits. Pipette la matrice membranaire du sous-sol et le milieu de haut en bas, puis incuber la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres et ajouter cinq millilitres de DMEM préchauré.
Puis centrifuger le tube à 400 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le supernatant. Resuspendez la pastille avec un millilitre de DMEM et transférez la solution dans une boîte de Pétri de 90 millimètres. Au microscope, ramasser 10 à 100 organoïdes tumoraux avec une pipette P200 et les recueillir dans un microtube sur la glace.
Centrifugez le microtube et retirez soigneusement le supernatant. Ensuite, maintenez la pastille sur la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour la chirurgie. Avant la transplantation submucosale de mur de réservoir souple, maintenez les seringues, les bouts de pipette, et la matrice de membrane de sous-sol sur la glace jusqu’à ce que prêt à employer.
Après que la souris a été anesthésiée, la poser dans une position supine et maintenir l’anesthésie par inhalation de masque de 2% isoflurane vaporisé. Appliquer l’iode de povidone avec une gaze stérile et essuyer avec 70% d’éthanol. Faire une petite incision transversale dans la peau et la paroi musculaire de l’abdomen inférieur de la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux stériles.
Exposez la vessie de la cavité abdominale et soutenez-la à l’aide d’un coton-tige salin trempé. Resuspendez les granulés organoïdes dans 80 microlitres de milieu organoïde contenant une matrice membranaire de sous-sol à concentration élevée de 50 % et injectez la suspension dans l’aspect antérieur du dôme de la vessie à l’aide de la seringue à insuline. Fermer l’incision avec une suture en nylon 4-0 et désinfecter le site chirurgical avec de l’iode povidone et 70% d’éthanol.
Laissez la souris récupérer sous un irradiateur infrarouge pendant 10 à 15 minutes. Puis surveillez à nouveau la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Des organoïdes de tumeur de réservoir souple de souris ont été établis et cultivés pendant neuf jours.
Si les cellules tumorales ne forment pas d’organoïdes tumoraux, elles ont été potentiellement tuées pendant l’étape de dissociation et le temps de digestion enzymatique peut devoir être ajusté. Les organoïdes de tumeur de réservoir souple ont exhibé les signaux forts de GFP avec l’infection lentiviral réussie. Après concentration, un total de 250 microlitres de virus contenant des médias a suffi à infecter 30 000 cellules tumorales individuelles sur la matrice membranaire du sous-sol et à maintenir une efficacité d’infection de 90 à 100%.
Des allographes de tumeur de réservoir souple ont été moissés trois semaines après transplantation orthotopique et l’histologie de la tumeur a été analysée utilisant la coloration de H&E. Les greffes orthotopiques d’organoïdes tumoraux peuvent se développer sous forme de tumeurs de la vessie pendant deux à trois semaines. Après cette procédure, les chercheurs peuvent effectuer l’immunohistochimie des organoïdes tumoraux résultants ou effectuer un RT-PCR quantitatif pour des gènes d’intérêt.
Ces expériences peuvent encore caractériser les organoïdes tumoraux. Notre protocole nous permet de manipuler les gènes dans les cellules cancéreuses facilement par rapport au modèle de souris tout en maintenant les caractéristiques in vivo des tumeurs afin d’étudier les fonctions spécifiques de divers gènes impliqués dans la tumorigène du cancer de la vessie.
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