Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Koronar progenitorceller och lösliga biomarkörer i kardiovaskulär prognos efter koronar angioplastik
Chapters
Summary January 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Utveckling av stora negativa kardiovaskulära händelser, som påverkar kardiovaskulär prognos efter koronar angioplastik, påverkas av omfattningen av koronar skador och vaskulär reparation. Användningen av nya koronar cellulära och lösliga biomarkörer, reaktiva till vaskulär skada och reparation, är användbara för att förutsäga utvecklingen av MACEs och prognos.
Transcript
Även angioplastik hjälper patienter med kranskärlssjukdom, kan kardiovaskulära händelser fortfarande inträffa efter ingreppet. Som MPCs och lösliga molekyler erhålls från koronarcirkulationen, kan de korreleras till graden av vaskulär skada och reparation. Koronar MPC och lösliga medlare nivåer därför kan användas för att uppskatta kardiovaskulär händelser och prognos hos patienter med kranskärlssjukdom genomgår koronar angioplastik.
MPCs och lösliga molekyler kan också användas för att uppskatta komplikationer och prognoser som uppstår under olika ischemisk inställningar, såsom återkommande lem ischemiary stroke. Demonstrerar förfarandet kommer att Eduardo Vera-Gomez och Alejandro Hernandez-Patricio, lab tekniker, och Karen De La Vega-Moreno och Carlos Zamora-Aleman, undergrad studenter. Också visar kommer att Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, en Master's of Science student, Alberto Melchor-Lopez, en doktorand, och Mario Antonio Tellez-Gonzalez, en Master's of Science medarbetare.
Inom en timme efter insamlingen överför du sex milliliter av det skördade blodprovet till ett koniskt rör på 15 milliliter och späder ut blodet i ett till ett förhållande i PBS. Tillsätt två milliliter av densitetsgradient medium till tre provrör och överför försiktigt tre lika stora alikvoter av utspädd blod till varje rör av densitetsgradientmedium. Separera cellerna genom centrifugering och överför cellerna vid gränssnittet till ett nytt rör.
Tvätta de insamlade cellerna en gång i två milliliter PBS i sex minuter, följt av sex tvättar i två milliliter färsk PBS per tvätt i två minuter. Efter den sista tvätten, åter upphäva MPC-innehållande cell pellet i en milliliter pbs för räkning och lägga till en gånger tio till de sex cellerna till märkta fem milliliter flöde cytometrirör. Pellet cellerna genom centrifugering och tillsätt 100 mikroliter av lämplig antikropp av intresse, utspädd i antikropps inkubation lösning till varje rör.
Blanda försiktigt cellerna med varje tillsatt antikroppscocktail i 10 sekunder och placera proverna på fyra grader Celsius, skyddad från ljus, i 20 minuter. Vid slutet av inkubationen centrifugerar proverna och åter uppställ pelletsen i 500 mikroliter pbs kompletterade med två millimolar EDTA. Använda isotype-matchade kontroller för att ställa in bakgrunden färgning, analysera proverna genom flöde cytometri enligt standardprotokoll, gating på lymfocyterna i en framåt vid sida scatter plot, att utesluta resterande granulocyter, cellulära skräp, och andra partiklar.
Ställ in en grind så att den innehåller ett högt antal celler med en CD45-positiv CD34-positiv fenotyp. Därefter använder cd45-positiva CD34-positiva gate för att välja för Kinas infoga domän receptor CD133 eller CD184-positiva celler. MPC-delpopulationerna kan sedan identifieras med sina specifika cellytmarkörer och rapporteras som procentandelen gated events.
För att bestämma koncentrationen av lösliga biomarkörer i de insamlade blodproverna, först, tvätta lämpliga pre-coated ELISA plattor två gånger med kit-provided tvätt buffert och etikett standard, prov, och kontrollrör. Centrifugera blodprovet för att separera blodkomponenterna och alikvotera plasman i provrören. Överför standarderna, proverna och kontrollerna till lämpliga brunnar och förslut och inkubera plattan i 37 grader Celsius i 90 minuter.
Vid slutet av inkubationen, kassera brunnsinnehållet och tillsätt biotindetekteringsantikroppen till varje brunn. Efter en timmes inkubation vid 37 grader Celsius, kassera plattan innehållet och tvätta brunnarna tre gånger med färsk tvätt buffert per tvätt. Efter den sista tvätten, inkubera proverna med Streptavidin arbetslösning i 30 minuter vid 37 grader Celsius följt av tre tvättar, som visats.
Efter den sista tvätten, behandla proverna med tetramethylbenzidinsubstrat i 30 minuter vid 37 grader Celsius. När färgen utvecklas, lägg till stopplösning från satsen och läs av den optiska densitetsabsorbansen i en mikroplatta ELISA-läsare. För att bestämma koncentrationen av tumörnekros faktor alfa, och interleukin-1 beta, med hjälp av immunomagnetisk multiplexering, etikett standard, prov, och kontroll rör och virvel den magnetiska pärla injektionsblad i 30 sekunder.
Lägg pärlor till lämpliga brunnar av multiplexering assay plattan. När alla pärlor har lagts till, sätt säkert in den handhållna magnetiska plattan bricka, och vänta två minuter för pärlorna att ackumuleras på botten av varje brunn, innan snabbt invertera både handhållna magnetiska plattan bricka, och plattan montering över en avfallsbehållare. Därefter lägger du till 150 mikroliter av tvättbuffert till varje brunn och vänta 30 sekunder för att låta pärlorna samlas på botten.
Kassera innehållet igen som bara visat och tillsätt 25 mikroliter av universell analys buffert och 25 mikroliter av de beredda standarder, prover och kontroller. Täta plattan för en minst 60 minuters inkubation, skyddad från ljus vid rumstemperatur, och 500 rotationer per minut. I slutet av inkubationen, tillsätt 150 mikroliter av tvättbuffert till varje brunn och låt pärlorna att bosätta sig i 30 sekunder.
Använd sedan tallriksbrickan för att kassera brunnsinnehållet och märk varje brunn med 25 mikroliter av detektionsantikroppsblandning följt av två tvättar, vilket visas. Efter den andra tvätten, inkubera proverna med 25 mikroliter streptavidin PE i 30 minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, tillsätt 120 mikroliter av läsbuffert till varje brunn och försegla plattan för en fem minuters inkubation, skyddad från ljus vid rumstemperatur, för 500 rotationer per minut.
Sedan, ladda plattan på en multiplexering assay läsare och justera avläsningsparametrar enligt varje analyt. Koronar, venus-sinus och perifert blod samlades in från 52 patienter som genomgick koronar angiografi och visat en hög prevalens av högt blodtryck och dyslipidemi. Den koronarkoncentrationen för baslinjen för de flesta MPC var signifikant lägre hos patienter som utvecklade stora negativa kardiovaskulära händelser, med en större minskning av MPC-subpopulationer CD34-positiva CD133-positiva och CD45-positiva, CD34-positiva, CD133- positiva, CD184- positiva.
På samma sätt hade patienter som utvecklade stora negativa kardiovaskulära händelser en ökad baslinje i koronarmängder av lösliga ICAM- 1 och lägre mängder metallomtrixprotein 9. Koronar MPCs och lösliga ICAM-1 visat en prognostisk förmåga för stora negativa kardiovaskulära händelse-fri överlevnad. Intressant nog visade uttrycket av tumör nekros faktor alfa variationer enligt tidpunkten för mätning och placeringen av den koronar provtagning baserat på en jämförelse av olika lumen områden vid samma födans gatan, med hjälp av intravaskulära ultraljud.
Under MPC isolering, se till att överföra blodet på densiteten gradient, och att samla cellerna från gränssnittet efter centrifugeringen noggrant. Periodisk virvelning förhindrar pärlutfällning och med hjälp av en magnetisk tallriksbricka hjälper till att hålla pärlorna inuti brunnarna under tvättar. Koronar MPCs och lösliga molekyler är användbara för stratifiering av risken för kardiovaskulära händelser under uppföljning efter angioplastik, bistå vid tillhandahållande av sekundära preventions till högriskpersoner som denna teknik återspeglar den patofysiologiska processen som sker under upphörandet av lösningen, det kan vara användbart för förhållanden där vaskulär biologi spelar en roll.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
