Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Adskillelse af cellekonvolutten for Gram-negative bakterier i indre og ydre membranfraktioner med tekniske justeringer for Acinetobacter baumannii
Chapters
Summary April 10th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Gram-negative bakterier producerer to rumligt adskilte membraner. Den ydre membran er opdelt fra den indre membran af en periplasm og et peptidoglycan lag. Evnen til at isolere de dobbelte tolag af disse mikrober har været afgørende for at forstå deres fysiologi og patogenese.
Transcript
Undersøgelse af, hvordan mikrober regulerer den kemiske sammensætning af de enkelte tolagser vil informere vores viden om mekanismer af antibiotika drab, antimikrobiel resistens og sygdomspatogenese. Denne teknik opdeler cellekonvolutten for gram-negative bakterier i to definerede fraktioner uden brug af vaskemiddel. Derfor kan lipider, proteiner og sukker vurderes i et miljø, der er semi-native.
Nogle af trinene er tidsafhængige og kræver fokus og koordinering. Brug i første omgang en eller to prøver. Når ens komfort niveau stiger, kan flere prøver tilføjes.
Der må ikke behandles mere end seks prøver på én gang. Dette er en flerdagsprocedure, og visuelle kontrolpunkter er nyttige til at vurdere effektivitet og fejl. Før du udfører dette nogle gange sidste trin.
Streak bakterierne fra frosne glycerol bestande på friske agar plader. Når kolonier udvikle, gemme pladerne på fire grader Celsius. Brug en enkelt koloni til at vaccinere en fem milliliter rør fyldt med bouillon medier og kultur bakterierne som ønsket natten over.
Tilbage fortynde natten bakteriekultur i en liter af de foretrukne bouillon medier og inkubere kolber. Når den ønskede optiske tæthed er opnået, fjernes kolberne fra inkubatoren, og de anbringes på is. Mål kulturens optiske tæthed ved 600 nanometer, og beregn den mængde kultur, der svarer til mellem seks og otte gange 10 til den ellevte bakteriekoloni, der danner enheder.
Tilsæt denne mængde kultur til et centrifugerør, og sørg for, at de resterende kulturer forbliver på is, indtil de skal bruges. Pellet bakterierne ved centrifugering i 10 minutter ina en fast vinkel, høj hastighed centrifuge på 7, 000 til 10, 000 gange G og fire grader Celsius. Supernatanten dekanteres forsigtigt, og den kasseres.
Resuspend hver celle pellet i 12,5 milliliter buffer A.Tilføj en magnetisk røre bar til cellen suspension. Der tilsættes 180 mikroliter på 10 mg pr. milliliterlyozym til hver celle resuspension. Efter indsamling af lysozym EDTA behandlede bakterier ved centrifugering, hurtigt tilføje protease hæmmer, magnesiumchlorid og nuklease til bakterier og hurtigt resuspend cellerne i buffer B.Stir i to minutter, holde suspensioner på is.
Dernæst tilsættes 12,5 milliliter 1,5 millimolar EDTA-opløsning til hver celle re-suspension og fortsætte omrøring på is i yderligere syv minutter. Suspensionerne dekanteres i 15 milliliter koniske rør. Centrifuge suspensioner på 9, 000 til 11, 000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Kassér supernatanterne i en beholder til biofarligt affald, og opbevar pillerne på is. Der tilsættes 25 milliliter buffer B til hver cellepellet. Derefter tilsættes 55 mikroliter af en molære magnesiumchlorid, en mikroliter af rnase/dnase/nukleoser og en mikroliter proteasehæmmercocktail.
Opspræn opsprænt pellets i blandingen. Kraftigt pipette og vortex, indtil opløsningerne ser homogene ud. Opbevar suspensionerne på is.
Prøven hældes i homogenisatorprøvecylinderen, og cellen bringes op på 20.000 PSI. For at undgå aerosolisering af patogener, betingelse det trykregulerede apparat i buffer B og justere trykniveauer, før du tilføjer bakteriel suspension. Trykcellen aktiveres, og der skal være 10 milliliter buffer B som en sikkerhedsforanstaltning.
Cellerne opsamls i 50 milliliter koniske rør på is, samtidig med at prøverne opbevares på is. For at opnå fuldstændig lysis gentages denne proces tre til fem gange. At pellet de resterende, intakt, cellemateriale, centrifuge de lysed bakterielle prøver på 6, 169 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.
Fordel supernatanterne, som nu indeholder de homogeniserede membraner, i polycarbonatflasker til ultracentrifugering. Ultracentrifuge cellen lyser ved 184, 500 gange G og fire grader Celsius i mindst en time. Kassér supernatanterne og opbevar membranpillerne på is.
Ved hjælp af et glas, Dounce homogenisator, resuspend membran piller i en milliliter af lav densitet isopycnic saccharose gradient løsning. Brug derefter et glas, Pasteur pipette til at overføre prøven homogenat til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og placere røret på is. For at forberede saccharosegradienten skal du holde et polypropylen- eller Ultra-clear Open-Top-rør i en let vippet position.
Tilsæt langsomt to milliliter af den højere densitet saccharoseopløsning. Derefter tilsættes fire milliliter af den lavere densitet saccharoseopløsning. Når tætheden er ved udarbejdelsen, tilsættes saccharoseopløsningen langsomt for at undgå at blande lagene.
Saccharoselagene skal være svagt synlige og fremstå som almindeligt definerede. Dernæst tilsættes den samlede membranfraktion, som tidligere blev resuspenderet i en milliliter lav tæthed, isopynic saccharoseopløsning. Endelig fyldes resten af røret ved at tilsætte ca. seks milliliter den lave massefylde, isopykniske saccharosegradientopløsning.
Ultracentrifuge prøverne ved hjælp af en svingende spand rotor ved 288, 000 gange G og fire grader Celsius i 16 til 23 timer. Skær enden af en P1000 pipette spids omkring fem milliliter fra det punkt. Når centrifugering er afsluttet, skal du bruge pipetten til at fjerne det øverste, brune lag fra røret.
Overfør dette lag, som indeholder den indre membranfraktion, til en polycarbonatflaske til ultracentrifugering. Der efterlades ca. to milliliter af saccharoseopløsningen over grænsefladen mellem 53%sucrose og 73%saccharose for at sikre, at den nederste, hvide, ydre membranfraktion ikke krydsforurerer den indre membranfraktion. Igen ved hjælp af en P1000 pipette spids med enden fjernet, fjerne den ydre membran lag og overføre det til en polycarbonat flaske.
Fyld det resterende tomrum af polycarbonatflaske med isoleret membranlagringsbuffer og bland ved inversion eller pippetting. Opbevar prøverne på is. For at indsamle membranerne, ultracentrifuge polycarbonat flasker på 184, 500 gange G og fire grader Celsius i en time.
Endelig kassere supernatants og tilføje 500 til 1, 000 mikroliter af opbevaring buffer. Resuspend membranerne ved Dounce homogenisering. Prøverne udtages i to milliliter mikrocentrifugerør.
Total membran pellets blev skrabet, Dounce homogeniseret og ultracentrifugeret over saccharosetæthed gradienter at adskille de indre og ydre membraner. En saccharosetæthed gradient på 20%53%73% var tilstrækkelig til partitionering nogle bakterielle stammer. Men ikke for partitionering A.baumannii, som blev partitioneret ved hjælp af en 20%45%73%gradient.
For at vurdere adskillelsens effektivitet blev membranprøver testet for NADH dehydrogenase, et enzym placeret i den bakterielle indre membran. Et fald i optisk tæthed ved 340 nanometer indikerede tilstedeværelsen af enzymet. Optisk tæthed blev målt for 50 mikrogram prøver af indre og ydre membranfraktioner af vild type S.typhimurium, E.coli K12 DH5a og galE mutant S.typhimurium.
En højere koncentration af protein blev tilføjet ved analyse af renheden af A.baumannii membranfraktioner, fordi en indledende analyse med 50 mikrogram tydede på, at de relative niveauer af NADH-dehydrogenase var lavere for A.baumannii end for de andre bakteriestammer. For at vurdere krydskontaminering af de indre membranfraktioner med ydre membranfraktioner blev LPS og LOS ekstraheret og visualiseret. Ekstrakterne blev læsset på en polyarylamid gel og farves med Pro-Q Emerald 300.
Acinetobacter baumannii er en topprioritet, multi resistent, humant patogen. Denne protokol bør hjælpe forskere med at forstå rollerne af lipooligosaccharider, fosfolipider og lipoproteiner i resistens og virulens mekanismer af denne unikke og vigtige patogen. Denne metode er ideel til downstream analyse af fosfolipider, glycolipids kulhydrater, proteiner og små molekyler, der typisk findes inden for de dobbelte membraner af gram-negative bakterier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
