Immunology and Infection
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아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리
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Summary April 10th, 2020
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그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.
Transcript
미생물이 개별 이중층의 화학 적 조성을 어떻게 조절하는지 연구하면 항생제 살인, 항균 내성 및 질병 병인의 메커니즘에 대한 지식을 알 릴 수 있습니다. 이 기술은 세제를 사용하지 않고 그램 음성 박테리아의 세포 봉투를 두 개의 정의된 분획으로 분할합니다. 따라서 지질, 단백질 및 설탕은 반 네이티브 환경에서 평가될 수 있습니다.
일부 단계는 시간에 따라 다르며 초점과 조정이 필요합니다. 처음에는 하나 또는 두 개의 샘플을 사용합니다. 편안함 수준이 높아지면 더 많은 샘플을 추가할 수 있습니다.
6개 이상의 샘플을 한 번에 처리해서는 안 됩니다. 이것은 다일 절차이며 시각적 검사점은 효능과 오류를 평가하는 데 도움이됩니다. 이 작업을 수행하기 전에 때로는 최종 단계를 수행합니다.
냉동 글리세롤 주식에서 신선한 한천 접시에 박테리아를 줄입니다. 식민지가 발달하면 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 단일 콜로니를 사용하여 국물 매체로 채워진 5 밀리리터 튜브를 접종하고 하룻밤 동안 원하는 대로 박테리아를 배양하십시오.
다시 바람직한 국물 매체의 한 리터로 하룻밤 세균 배양을 희석하고 플라스크를 배양. 원하는 광학 밀도가 달성되면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 600 나노미터에서 배양의 광학 밀도를 측정하고 11번째 세균식민지 형성 단위에 6~8배 10배 사이의 배양량을 계산한다.
원심분리기 튜브에 이 문화양을 추가하고 나머지 문화권이 사용될 때까지 얼음 위에 머무르도록 합니다. 10분 동안 원심분리에 의해 박테리아를 펠트렛은 고정 각도, 고속 원심분리기 7, 000 ~ 10, 000배 G 및 섭씨 4도입니다. 신중하게 상체를 장식하고 폐기.
버퍼 A.의 12.5 밀리리터에서 각 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 각 세포 재서스펜션에 밀리리터 리조지메 당 10 밀리그램의 180 마이크로리터를 추가합니다. 리소지메 EDTA 처리된 박테리아를 원심분리에 의한 후, 프로테아제 억제제, 염화 마그네슘 및 뉴클레아아제를 박테리아에 빠르게 추가하고 완충 B.Stir에서 세포를 2분 간 빠르게 재보페치하여 얼음에 현탁액을 유지합니다.
다음으로, 각 셀재서스펜션에 1.5 밀리리터 1.5 밀리리터를 추가하고 7분 동안 얼음위를 계속 저어줍니다. 서스펜션을 15밀리리터 원뿔 튜브로 디산합니다. 서스펜션은 섭씨 9, 000에서 11, 000배 G로 섭씨 4도에서 10분 동안 정지를 분리합니다.
수퍼나츠를 생물위험 폐기물 용기에 버리고 얼음 위에 펠릿을 보관하십시오. 각 셀 펠릿에 버퍼 B 25 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 1개의 어금니 마그네슘 염화물, rnase/dnase/nuclease 시약의 1개의 마이크로리터 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1개의 마이크로리터의 55마이크로리터를 추가합니다.
혼합물의 펠릿을 다시 중단합니다. 솔루션이 균일하게 나타날 때까지 적극적으로 파이펫과 소용돌이. 서스펜션을 얼음 위에 보관합니다.
균질화 샘플 실린더에 샘플을 붓고 세포를 20, 000 PSI로 가져옵니다. 병원균의 에어로졸화를 피하기 위해, 가압 장치를 완충 B로 조건화하고 세균 현탁액을 추가하기 전에 압력 수준을 조절한다. 압력 셀을 참여시키고 예방 조치로 버퍼 B의 10 밀리리터를 암시하십시오.
얼음에 50 밀리리터 원판 튜브에 세포 lysate를 수집하는 동시에 얼음에 샘플을 유지합니다. 완전한 리시스를 얻으려면 이 프로세스를 3~5회 반복합니다. 나머지, 그대로, 세포 물질, 1심 분리기는 10 분 동안 6, 169 시간 G 및 섭씨 4도에서 lysed 세균 샘플을 원심분리합니다.
이제 균질화된 멤브레인을 포함하는 초나츠를 극심분리용 폴리카보네이트 병에 분배합니다. 초원심분리기 세포는 184, 500배 G 및 4°C에서 적어도 한 시간 동안 용해됩니다. 수퍼네이츠를 버리고 얼음 위에 멤브레인 펠릿을 유지합니다.
유리를 사용하여, Dounce 균질화, 저밀도 이소피크닉 자당 그라데이션 용액의 1 밀리리터에서 멤브레인 펠릿을 재연. 그런 다음 유리, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브로 균형 샘플을 전송하고 튜브를 얼음에 놓습니다. 자당 그라데이션을 준비하려면 약간 기울어진 위치에 폴리 프로필렌 또는 울트라 클리어 오픈 탑 튜브를 유지하십시오.
고밀도 자당 용액의 2밀리리터를 천천히 추가합니다. 그런 다음 저밀도 자당 용액의 4 밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션을 준비할 때 자당 용액을 천천히 추가하여 레이어를 혼합하지 않도록 합니다.
자당 층은 약간 표시되어야하며 일반적으로 정의 된 것처럼 보입니다. 다음으로, 이전에 저밀도, 이소피크닉 자당 용액의 1 밀리리터로 재중단된 총 멤브레인 분획을 추가합니다. 마지막으로, 저밀도, 이소피크닉 자당 그라데이션 용액의 약 6 밀리리터를 추가하여 튜브의 나머지 부분을 채웁니다.
초원심분리기는 16~23시간 동안 288회, 000배, 섭씨 4도에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 샘플을 채취한다. 지점에서 약 5 밀리리터에 대한 P1000 파이펫 팁을 끝을 잘라. 원심분리가 완료되면 파이펫을 사용하여 튜브에서 상부, 갈색 층을 제거합니다.
내부 멤브레인 분획을 포함하는 이 층을 극심분리용 폴리카보네이트 병으로 옮긴다. 53%의 자당과 73% 자당 사이의 인터페이스 위에 자당 용액의 약 2밀리리터를 남겨두어 하부, 흰색, 외부 멤브레인 분획이 내부 멤브레인 분획을 오염시키지 않도록 한다. 끝이 제거된 P1000 파이펫 팁을 다시 사용하여 외부 멤브레인 층을 제거하고 폴리카보네이트 병으로 옮킵니다.
폴리카보네이트 병의 나머지 공백을 격리된 멤브레인 저장 버퍼로 채우고 반전 이나 핍펫팅으로 섞는다. 얼음 에 샘플을 유지합니다. 멤브레인을 수집하기 위해 폴리 카보네이트 병을 184, 500 배 G 및 섭씨 4도에서 1 시간 동안 초원심 분리합니다.
마지막으로, 슈퍼네틱을 버리고 500에서 1, 000 마이크로리터의 스토리지 버퍼를 추가합니다. Dounce 균질화에 의해 멤브레인을 다시 중단합니다. 2밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 샘플을 수집합니다.
총 멤브레인 펠릿은 내부 및 외부 멤브레인을 분리하기 위해 자당 밀도 그라데이션위에 균질화되고 초원성 분리되었다. 자당 밀도 그라데이션20%53%73%는 세균균을 분할하기에 충분했다. 그러나 20%45%73%의 그라데이션을 사용하여 성공적으로 분할된 A.baumannii를 분할하는 것은 아닙니다.
분리의 효율을 평가하기 위해, 멤브레인 샘플은 세균 내막에 위치한 효소인 NADH 탈수소효소를 테스트하였다. 340 나노미터에서 광학 밀도의 감소는 효소의 존재를 나타냈다. 광학 밀도는 야생 형 S.typhimurium, E.coli K12 DH5a 및 galE 돌연변이 S.typhimurium에서 내부 및 외부 멤브레인 분획의 50 마이크로그램 샘플을 측정하였다.
50 마이크로그램을 사용한 초기 분석이 NADH 탈수소효소의 상대적 수준이 다른 세균균균에 비해 A.baumannii에 대해 더 낮았다는 것을 시사했기 때문에 A.baumannii 막 분획의 순도를 분석할 때 단백질의 더 높은 농도가 추가되었습니다. 외부 멤브레인 분획을 가진 내부 막 분획의 교차 오염을 평가하기 위해 LPS 및 LOS는 추출및 시각화되었습니다. 추출물은 폴리아크릴아미드 젤에 적재되어 Pro-Q 에메랄드 300으로 염색되었습니다.
아신토박터 바우만이는 최우선 과제, 다중 약물 내성, 인간 병원균이다. 이 프로토콜은 이 독특하고 중요한 병원체의 저항 그리고 독성 기계장치에 있는 lipooligosaccharides, 인지질 및 지단백질의 역할을 이해하는 연구원을 원조해야 합니다. 이 방법은 일반적으로 그람 음성 박테리아의 이중 막 내에 존재하는 인지질, 글리콜리피드 탄수화물, 단백질 및 작은 분자의 다운스트림 분석에 이상적입니다.
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