Immunology and Infection
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एसिनेटोबैक्टर बौमैनी के लिए तकनीकी समायोजन के साथ इनर और बाहरी झिल्ली अंशों में ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए सेल लिफाफे का पृथक्करण
Chapters
Summary April 10th, 2020
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ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दो स्थानिक रूप से अलग झिल्ली का उत्पादन करते हैं। बाहरी झिल्ली को आंतरिक झिल्ली से एक परिधीय और पेप्टिडोग्लिकन परत द्वारा विभाजित किया जाता है। इन रोगाणुओं के दोहरे बाइलेयर को अलग करने की क्षमता उनके शरीर विज्ञान और रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रही है।
Transcript
अध्ययन कैसे रोगाणुओं व्यक्तिगत bilayers की रासायनिक संरचना को विनियमित एंटीबायोटिक हत्या, रोगाणुरोधी प्रतिरोध और रोग रोगजनकता के तंत्र के बारे में हमारे ज्ञान को सूचित करेगा । यह तकनीक डिटर्जेंट का उपयोग किए बिना ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के सेल लिफाफे को दो परिभाषित अंशों में विभाजित करती है। इसलिए, लिपिड, प्रोटीन और शर्करा का आकलन अर्ध-देशी वातावरण में किया जा सकता है।
कुछ कदम समय पर निर्भर हैं और इसके लिए ध्यान और समन्वय की आवश्यकता है । प्रारंभ में, एक या दो नमूनों का उपयोग करें। जब किसी का आराम स्तर बढ़ जाता है, तो अधिक नमूने जोड़े जा सकते हैं।
एक बार में छह से अधिक नमूनों को नहीं संभाला जाना चाहिए। यह एक बहु-दिवसीय प्रक्रिया है और दृश्य चौकियां प्रभावकारिता और त्रुटि का आकलन करने में सहायक होती हैं। इस प्रदर्शन से पहले कभी कभी अंतिम कदम.
ताजा आगर प्लेटों पर जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक से बैक्टीरिया लकीर । एक बार उपनिवेशों का विकास, चार डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करें । एक ही कॉलोनी का उपयोग करने के लिए एक पांच मिलीलीटर शोरबा मीडिया और संस्कृति के रूप में वांछित रातोंरात बैक्टीरिया से भरा ट्यूब टीका ।
वापस पसंदीदा शोरबा मीडिया के एक लीटर में रातोंरात जीवाणु संस्कृति पतला और फ्लास्क इनक्यूबेट । जब वांछित ऑप्टिकल घनत्व प्राप्त हो गया है, तो इनक्यूबेटर से फ्लैक्स निकालें और उन्हें बर्फ पर रखें। 600 नैनोमीटर पर संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें और संस्कृति की मात्रा की गणना करें जो ग्यारहवें बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के लिए छह से आठ गुना 10 के बराबर है।
संस्कृति की इस मात्रा को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें और यह सुनिश्चित करें कि शेष संस्कृतियां बर्फ पर तब तक रहें जब तक कि उनका उपयोग न किया जाए। 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया गोली एक निश्चित कोण, उच्च गति अपकेंद्रित्र 7, 000 से 10, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेट को सावधानी से डिकंट करें और उसे त्याग दें।
बफर ए के 12.5 मिलीलीटर में प्रत्येक सेल गोली को फिर से रखें सेल निलंबन में एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें। प्रत्येक सेल रिसोपेनसेशन में 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर लिसोजिमे के 180 माइक्रोलीटर जोड़ें। lysozyme EDTA अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया का इलाज इकट्ठा करने के बाद, जल्दी से बैक्टीरिया के लिए प्रोटीज अवरोधक, मैग्नीशियम क्लोराइड और नाभिक जोड़ें और तेजी से बफर बी में कोशिकाओं को फिर से खर्च करते हैं, बर्फ पर निलंबन रखते हुए ।
इसके बाद, प्रत्येक सेल री-सस्पेंशन में 1.5 मिलीमोलर ईडीटीए समाधान के 12.5 मिलीलीटर जोड़ें और अतिरिक्त सात मिनट के लिए बर्फ पर सरगर्मी जारी रखें। 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में निलंबन को डिकेंट करें। सस्पेंशन को 9, 000 से 11, 000 बार जी पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सस्पेंशन ।
सुपरनेटैंट्स को बायोहैजार्ड अपशिष्ट कंटेनर में फेंकें और बर्फ पर छर्रों को बनाए रखें। प्रत्येक सेल पेलेट में बफर बी के 25 मिलीलीटर जोड़ें। इसके बाद एक मोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के 55 माइक्रोलीटर, आरएनस/डीएनएस/न्यूक्लियेज रीएजेंट का एक माइक्रोलीटर और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल का एक माइक्रोलीटर डालें।
मिश्रण में छर्रों को फिर से खर्च करें। जब तक समाधान समरूप दिखाई देते हैं तब तक सख्ती से पिपेट और भंवर। बर्फ पर निलंबन स्टोर करें।
होमोजेनाइजर सैंपल सिलेंडर में सैंपल डालें और सेल को 20 हजार पीएसआई पर लाएं। रोगजनकों के एयरोसोलाइजेशन से बचने के लिए, बफर बी में दबाव तंत्र की स्थिति और बैक्टीरियल निलंबन जोड़ने से पहले दबाव के स्तर को समायोजित करें। एहतियात के रूप में दबाव सेल और ब्लर बी के 10 मिलीलीटर को शामिल करें।
बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंकु नलियों में सेल को ले लीजिए, जबकि बर्फ पर नमूने भी रखे जाते हैं। पूर्ण रूप से प्राप्त करने के लिए, इस प्रक्रिया को तीन से पांच बार दोहराएं। शेष, बरकरार, सेल सामग्री, 6, 169 बार जी और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर lysed जीवाणु नमूनों को गोली करने के लिए।
अतिकेंद्री के लिए पॉलीकार्बोनेट बोतलों में, जो अब समरूप झिल्ली होते हैं, जो सुपरनेटेंट वितरित करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज सेल 184, 500 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस कम से कम एक घंटे के लिए होता है। सुपरनेटेंट को त्यागें और बर्फ पर झिल्ली छर्रों को बनाए रखें।
एक गिलास, Dounce समरूपता का उपयोग करना, कम घनत्व आइसोपिक सुक्रोज ढाल समाधान के एक मिलीलीटर में झिल्ली छर्रों को फिर से खर्च करें। फिर, नमूना समरूप को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने और ट्यूब को बर्फ पर रखने के लिए एक ग्लास, पाश्चुर पिपेट का उपयोग करें। सुक्रोज ढाल तैयार करने के लिए, थोड़ी झुकी हुई स्थिति में पॉलीप्रोपाइलीन या अल्ट्रा-क्लियर ओपन-टॉप ट्यूब रखें।
धीरे-धीरे उच्च घनत्व सुक्रोज समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें। फिर कम घनत्व सुक्रोज समाधान के चार मिलीलीटर जोड़ें। घनत्व ढाल तैयार करते समय, परतों को मिलाने से बचने के लिए धीरे-धीरे सुक्रोज समाधान जोड़ें।
सुक्रोज परतों को थोड़ा दिखाई देना चाहिए और आम तौर पर परिभाषित दिखाई देना चाहिए। इसके बाद, कुल झिल्ली अंश जोड़ें जिसे पहले कम घनत्व, आइसोप्निक सुक्रोज समाधान के एक मिलीलीटर में पुनः निलंबित कर दिया गया था। अंत में, कम घनत्व, आइसोप्निक सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान के लगभग छह मिलीलीटर जोड़कर ट्यूब के शेष को भरें।
अल्ट्रासेंट्रफ्यूज नमूनों में 288, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर झूलती बाल्टी रोटर का उपयोग करके 16 से 23 घंटे तक किया जाता है। बिंदु से पांच मिलीलीटर के बारे में एक P1000 पिपेट टिप बंद अंत काटें। अपकेंद्रित्र पूरा होने के बाद, ट्यूब से ऊपरी, भूरे रंग की परत को हटाने के लिए पिपेट का उपयोग करें।
इस परत को स्थानांतरित करें, जिसमें आंतरिक झिल्ली अंश होता है, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के लिए पॉलीकार्बोनेट बोतल में। 53% सुक्रोज और 73% सुक्रोज के बीच इंटरफ़ेस के ऊपर सुक्रोज समाधान के बारे में दो मिलीलीटर छोड़ दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि निचले, सफेद, बाहरी झिल्ली अंश आंतरिक झिल्ली अंश को पार नहीं करता है। फिर से अंत के साथ एक P1000 पिपेट टिप का उपयोग करके, बाहरी झिल्ली परत को हटा दें और इसे पॉली कार्बोनेट बोतल में स्थानांतरित करें।
पॉली कार्बोनेट बोतल के शेष शून्य को अलग झिल्ली भंडारण बफर के साथ भरें और उलटा या पिपेटिंग द्वारा मिलाएं। बर्फ पर नमूनों को बनाए रखें। झिल्ली एकत्र करने के लिए, एक घंटे के लिए 184, 500 गुना जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पॉलीकार्बोनेट की बोतलों को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज करें।
अंत में, सुपरनेटेंट को त्यागें और स्टोरेज बफर के 500 से 1, 000 माइक्रोलीटर जोड़ें। 2यूंस समरूपता द्वारा झिल्ली को फिर से खर्च करें। दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में नमूने एकत्र करें।
आंतरिक और बाहरी झिल्ली को अलग करने के लिए कुल झिल्ली छर्रों को स्क्रैप किया गया था, डोरोस समरूप और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज किया गया था। कुछ जीवाणु उपभेदों को विभाजित करने के लिए 20% 53% 73% का सुक्रोज घनत्व ढाल पर्याप्त था। लेकिन A.baumannii जो सफलतापूर्वक एक 20% 45% 73% ढाल का उपयोग कर विभाजित किया गया विभाजन के लिए नहीं।
पृथक्करण की दक्षता का आकलन करने के लिए, झिल्ली के नमूनों का परीक्षण एनएचएच डिहाइड्रोजनेज के लिए किया गया था, जो जीवाणु आंतरिक झिल्ली में स्थित एंजाइम था। 340 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व में कमी ने एंजाइम की उपस्थिति का संकेत दिया। ऑप्टिकल घनत्व जंगली प्रकार S.typhimurium, ई. कोलाई K12 DH5a और galE उत्परिवर्ती S.typhimurium से आंतरिक और बाहरी झिल्ली अंशों के ५० माइक्रोग्राम नमूनों के लिए मापा गया था ।
ए. बॉमनी झिल्ली अंशों की शुद्धता को बताते समय प्रोटीन की उच्च एकाग्रता जोड़ी गई थी क्योंकि 50 माइक्रोग्राम का उपयोग करके एक प्रारंभिक परख ने सुझाव दिया था कि अन्य जीवाणु उपभेदों की तुलना में एनएचएच डिहाइड्रोजनेज़ का सापेक्ष स्तर ए. बाउमैनी के लिए कम था। बाहरी झिल्ली अंशों के साथ आंतरिक झिल्ली अंशों के पार संदूषण का आकलन करने के लिए, एलपीएस और लॉस निकाले गए और कल्पना की गई। अर्क एक पॉलीएक्रीलामाइड जेल पर लोड किए गए थे और प्रो-क्यू एमराल्ड 300 के साथ दाग दिए गए थे।
Acinetobacter baumannii एक सर्वोच्च प्राथमिकता है, बहु दवा प्रतिरोधी, मानव रोगजनक है । इस प्रोटोकॉल को शोधकर्ताओं को इस अनूठे और महत्वपूर्ण रोगजनक के प्रतिरोध और उग्रता तंत्र में लिपूलिगोसाकराइड्स, फॉस्फोलिपिड्स और लिपोप्रोटीन की भूमिकाओं को समझने में सहायता करनी चाहिए। यह विधि फॉस्फोलिपिड्स, ग्लाइकोलिपिड्स कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन और छोटे अणुओं के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आदर्श है जो आमतौर पर ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की दोहरी झिल्ली के भीतर मौजूद होते हैं।
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