This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifiering av cytotoxiciteten hos staphyloccus aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter
Chapters
Summary January 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver en metod för rening av polymorfonukleära leukocyter från hela humanblod och två distinkta analyser som kvantifierar cytotoxiciteten av Staphylococcus aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller.
Transcript
Staphylococcus aureus är en grampositiv bakterie som producerar ett brett spektrum av virulensfaktorer som främjar patogenes. Dessa inkluderar bikomponent leukotoxiner som stör membranet integritet polymorfouklear leukocyter, även kallad PMNs eller neutrofiler. Denna video illustrerar isoleringen av PMNs från mänskliga helblod och två distinkta analyser för kvantifiera S.aureus cytotoxicitet mot dessa viktiga medfödda immunceller.
Dessa analyser kan alla åstadkommas med standard laboratorieutrustning och är lätt anpassningsbara för att undersöka andra aspekter av värd patogen interaktion. Dessa experiment kommer att använda helblod från mänskliga givare och kommer att kräva godkännande från lämplig institutionell kommitté eller granskningsnämnd samt ett uttalande om att informerat samtycke erhölls från alla deltagare. Det första steget i detta förfarande är isolering av neutrofiler genom användning av centrifuger och densitet gradienter.
För det första, ta med 50 milliliter av 3%dextran 0,9%natriumklorid, 35 milliliter 0,9%natriumklorid, 20 milliliter av 1,8%natriumklorid, 12 milliliter på 1,077 gram per milliliter ficoll-lösning och 20 milliliter vatten till rumstemperatur. Överför 25 milliliter av nyritat hepariniserat helmänskligt blod till två koniska centrifugrör. Kombinera 25 milliliter nyritat hepariniserat helblod med 25 milliliter motsvarande volym av rumstemperatur, 3%dextran, 0,9%natriumklorid i ett ett-till-ett-förhållande.
Blanda genom att försiktigt gunga varje 50 milliliter koniskt rör och låt sedan stå i rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubation vid rumstemperatur kommer två separata lager att visas. Överför det översta lagret av varje dextran blodblandning i nya 50 milliliter koniska rör.
Centrifugera vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur med låga eller inga pauser. Aspirera försiktigt både supernatanter och kassera utan att störa cellpelletsen. Försiktigt återanvänd varje cell pellet i två milliliter av 0,9%natriumklorid.
Kombinera återanvända pellets i en enda, 50 milliliter konisk tillsätt sedan de återstående 0,9%natriumklorid till en slutlig volym på 35 milliliter. Lägg försiktigt 10 milliliter på 1,077 gram per milliliter ficoll-lösning under cellfjädringen med hjälp av en handpipett. Efter spinning på 450 g i 30 minuter vid rumstemperatur, med låga eller inga pauser, försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelletsen, som tidigare visats.
Lysa de röda blodkropparna genom att resuspending cell pelleten i 20 milliliter av rumstemperatur vatten. Blanda försiktigt genom att gunga i 30 sekunder. Tillsätt omedelbart 20 milliliter av 1,8%natriumklorid och centrifugprov vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur.
Aspirera försiktigt supernatant som visats tidigare. Försiktigt återanvänd cell pelleten i två milliliter rumstemperatur RPMI och placera på is. Räkna celler med hjälp av en hemacytometer.
Resuspend renat PMNs vid en koncentration av en gång 10 till 7: e celler per milliliter med iskall RPMI och hålla på is. Kombinera 100 mikroliter av renade PMNs med 300 mikroliter av DPBS, innehållande en mikroliter av propidium iodidfläck i två replikat flödescytometrirör. För en positiv kontroll, tillsätt 40 mikroliter av 0,5%Triton X-100 lösning i en av flödescytometrirören och blanda noggrant.
Använd flödescytometri för att mäta framåtspridd, sidospridning och propidium-iodidfärgning för att bestämma renhet och integritet hos isolerade PMNs. Endast PMN-preparat som ligger över 98%ren och över 95%propidium iodidenegativa skall användas. För protokollet som beskriver isoleringen av normalt humant serum, hänvisa till det fullständiga manuskriptet.
Förbered en 96-brunnsplatta för PMN cytotoxicitetsanalyser genom att tillsätta 100 mikroliter av 20%isolerade humant serum utspädd med DPBS till enskilda brunnar som kommer att användas i denna analys. Var noga med att inkludera minst en negativ kontroll väl som bara kommer att få media och minst en positiv kontroll väl som kommer att få 0,05%Triton X.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubationen, tvätta kodade brunnar två gånger med 100 mikroliter av iskall DPBS och placera plattan på is.
Ta bort eventuella kvarvarande DPBS från plåt brunnar och försiktigt lägga 100 mikroliter av renad mänskliga PMNs på en gång 10 till 7: e celler per milliliter till varje kodade väl. Låt pläterade neutrofiler bosätta sig genom att lämna dem på is i minst fem minuter före användning i följande cytotoxicitetsanalyser. Detta avsnitt beskriver en analys som kvantifierar cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av staph aureus mot mänskliga PMNs.
Kultur S.aureus över natten i lämpliga medier med hjälp av en skakande inkubator inställd på 37 grader Celsius dagen före experimentet. Subkultur S.aureus genom att utföra en en till 100 utspädning av natten bakterier kulturer med färska medier. Inkubera vid 37 grader Celsius med skakningar tills bakterier når tidig stationär tillväxtfas.
Efter fem timmars tillväxt, överför en milliliter subkultur S.aureus till en 1,5 milliliter microcentrifug rör och centrifug vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugeringen, aspirera supernatanter. Passera aspirerade supernatanter genom ett 0,22 mikronsprutfilter till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och placera på is.
Utför serieutspädningar av supernatanter med iskall media som används för att odla Staph aureus. Tillsätt försiktigt supernatant prover eller media lånas ut för negativa och positiva kontroller till enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta som innehåller PMNs på is, som beskrivits tidigare. Försiktigt bergplatta för att fördela supernatanter i brunnar och inkubera i 37 grader Celsius.
Vid önskade tidpunkter, ta bort plåt från inkubatorn och placera på is. Tillsätt 300 mikroliter av iskall DPBS som innehåller en mikroliter av propidium iodide till varje flödescytometrirör. Överför proverna till flödescytometrirör på is.
För den positiva kontroll väl, tillsätt 20 mikroliter av 10%Triton X till provet före överföring till ett flöde cytometri rör. Analysera propidium iodid färgning av berusade PMNs med hjälp av flödescytometri. Detta avsnitt beskriver en analys som kvantifierar cytotoxicitet av S.aureus efter fagocytos av mänskliga PMNs.
Tillväxtkurvor som definieras av den optiska densiteten vid 600 nanometer och koncentrationen av bakterier måste bestämmas för de relevanta Staph aureusstammarna före användning i denna analys. Börja över natten kulturer av S.aureus stammar och subkultur bakterier, som beskrivits tidigare. När subkulturerade Staph aureus har nått mitten av exponentiell tillväxt, överföra en milliliter av kultur bakterier till 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och centrifug vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur.
Tvätta S.aureus genom att aspirera dess supernatant utan att störa pelleten och resuspend de pelleterade bakterierna vid en milliliter DPBS. Vortexa proverna i 30 sekunder. Centrifugera proverna vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur.
Till oxenize Staph aureus, först resuspend den bakteriella pelleten i en milliliter av 20%humant serum. Inkubera sedan prover vid 37 grader Celsius med agitation i 15 minuter. Tvätta oxenized Staph aureus efter centrifugeringen som visat tidigare.
Späd oxenized Staph aureus stammar till en gånger 10 till den 8: e kolonin-formande enheter, CFUs per milliliter, med iskall RPMI. Vortexa provet i 30 sekunder och placera på is. Bekräfta koncentrationerna av Staph aureus som används för dessa analyser genom att plätering en till 10 serieutspädningar av bakterier på agar.
Tillsätt försiktigt 100 mikroliter per brunn av varje Staph aureus-stam, eller RPMI för positiva och negativa kontroller, till PMNs i en 96-brunnsplatta på is från steg 1,14. Försiktigt rockplatta för att fördela Staph aureus i brunnar. Synkronisera fagocytos genom centrifugering plattan vid 500 g i åtta minuter vid fyra grader Celsius och inkubera plattan vid 37 grader Celsius omedelbart efter centrifugering som tid noll.
Vid de önskade tidpunkterna, lägg plattan på is och tillsätt 200 mikroliter av iskall DPBS som innehåller en mikroliter propidium iodide till varje flöde cytometri röret sedan överföra prover till deras motsvarande rör. Analysera prover för propidium iodidfärgning med hjälp av flödescytometri enligt beskrivningen i 2.8 och 2.9. Transkriptionen av bi-komponent leukotoxiner som riktar mänskliga PMNs av Staph aureus kräver att SA eller S2 komponentsystemet att visa nyttan av de beskrivna assays för kvantifierande Staph aureus cytotoxicitet mot mänskliga PMNs.
Dessa experiment utfördes med en kliniskt relevant Staph aureus isolat identifieras som USA300 i en isologenic borttagning mutant av SA eller S i denna stam. Den vänstra panelen föreställer renade PMNs och den högra panelen avbildar avsiktligt förorenade prover som ett exempel. PMNs isolerade med hjälp av de förfaranden som beskrivs i avsnitt ett av detta protokoll var färgas med propidium iodide och undersökas med hjälp av flöde cytometry.
Framåt och sida scatter tomter användes för att upptäcka kontaminering av renat PMNs av monocyter eller lymfocyter i år 1A och 1B. PMN integritet bestämdes med hjälp av propidium iodid färgning. Genom att använda den beskrivna metoden för mänskliga PMN rening, kan vi konsekvent isolera fem gånger 10 till den 7: e till en gånger 10 till den 8: e PMNs som är över 98%ren och är över 95%propidium iodide negativ.
Cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av USA300 och AsaeR/S mutant testades mot renat PMNs. Dessa experiment visar en koncentration beroende ökning av propidium iodid färgning av renad PMNs efter 30 minuter av berusning med extracellulära proteiner som produceras av USA300, men inte med AsaeR /S mutant. Ytterligare experiment visade en stadig ökning av andelen propidium iodid positiva PMNs efter berusning av USA300 extracellulära proteiner som planade efter cirka 30 minuter.
Minimal propidium iodid färgning av mänskliga PMNs noterades vid alla tidpunkter efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av AsaeR/S mutant. Sist, cytotoxicitet av USA300 och AsaeR/S mutant mot PMNs efter synkroniserade fagocytos testades, en koncentration beroende ökning av andelen propidium iodide positiva PMNs observerades 90 minuter efter fagocytos av USA300. Betydligt färre PMNs var propidium iodide positiva efter fagocytos av AsaeR/S mutant.
Uppräkning av USA300 och AsaeR/S mutant inokulat användes i vart och ett av dessa experiment visade att kontrasten i cytotoxicitet mellan dessa stammar inte berodde på skillnader i koncentrationen av bakterier som används. Detta protokoll beskriver rening av PMN från humant blod i två distinkta tekniker för kvantifiera cytotoxicitet S.aureus mot dessa medfödda immunceller. Framgången för dessa förfaranden kommer att bero på kvaliteten på de renade PMNs och lämplig beredning av Staph aureus bakterier eller supernatanter.
Vänligen konsultera hela manuskriptet för viktiga punkter att överväga när du utför dessa förfaranden. USA300 är en virulent MRSA-isolat och förlusten av AsaeR /S minskar dramatiskt transkription av virulensfaktorer som riktar sig mot mänskliga PMNs, vilket gör dessa stammar idealiska modeller för att jämföra cytotoxicitet med hjälp av de analyser som beskrivs. Skräddarsy tillväxtförhållanden, volymer av supernatanter till, eller förhållandet mellan bakterier till PMNs kan krävas när du använder andra stammar av Staph aureus.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
