İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Bu protokol, mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölüm modlarını açıkça ayırt edebilir. Paralel olarak birden fazla embriyo gözlemleyerek, büyük ölçüde tüm makrofaj litik hücre ölüm sürecinin yakalama olasılığını artırır. Bu protokol aynı zamanda enfeksiyon veya steril inflamasyon içeren benzer senaryolarda hücre ölümü ve diğer hücresel davranış gözlem uygulanabilir.

Genişletilmiş canlı görüntüleme sırasında, fotobeyazrlama ve toksisite önlemek için mümkün olduğunca düşük lazer yoğunluğunu tutmak için çok önemlidir. El yazmasına göre aşılamadan sonra, mycobacterium marinum’u pelet olarak toplamak için kültürü 3000 kat G’de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant’ın 300 mikrolitresi hariç hepsini atın ve peleti yeniden askıya alın.

Pelet daha fazla yeniden askıya almak için% 10 gliserol ile 7H9 orta üç mililitre ekleyin, ve sonra 100 watt bir su banyosunda süspansiyon sonicate, ile 15 saniye ve 15 saniye kapalı, tek bir hücre homojen elde etmek için toplam iki dakika. Bakteriyel süspansiyonu 10 mililitrelik şırıngaya aktarın ve bakteri kümelerini çıkarmak için beş mikronluk bir filtreden geçirin. Bir spektrofotometre kullanarak, süspansiyon optik yoğunluğunu ölçmek ve 7H9 medya içeren seyreltmek 10% gliserol ile OD 600 bir.

Süspansiyonu 10 mikrolitrelik aliquots’a bölün ve daha fazla kullanım için negatif 80 santigrat derecelik dondurucuda saklayın. İlk olarak, tamamen eriyene kadar 95 derece santigrat ısı blok agarose ısıtın. Agarose’u 45 santigrat derecelik bir ısıtma bloğuna yerleştirerek sıvı halde muhafaza edin.

Gövde bölgesinde kas içi enfeksiyon için monte etmek için, bir cam slayt üzerine eşit hacim agarose hacim tarafından% 1 ağırlık 0,5 mililitre dökerek alt agarose tabakası oluşturun. Katılaşmak için kaydırağı bir buzluk veya soğuk yüzeye üç dakika yerleştirin. Zebra balığı embriyolarını uyuşturdıktan sonra, alt agarose tabakasına 60 zebra balığı embriyosu yerleştirin ve iki sıra halinde dikkatlice yerleştirin.

Üst tabaka oluşturmak için hacim agarose tarafından 0.3% mililitre eklemeden önce, doku kağıt ile alt agarose tabakası üzerinde kalan su çıkarın. Embriyoların agarose’a tamamen gömülü olduğundan emin olun. Agarose katılaşmak için tekrar buzluk için cam slayt dönün.

Ekstra E3 yumurta suyu ile yüzeyi kaplayarak agarose üst tabakası nemli tutun. Daha sonra, mikroenjektör ve mikromanipülörü uygun konuma ve mikroenjeksiyon için ayara ayarlayın. Hazırlanan bakteri kültürünün üç mikrolitresini mikroloader kullanarak hazırlanan iğneye aktarın.

Pipet yavaş ve dikkatli hava kabarcıkları oluşturan önlemek için. Gövde bölgesine 100 CFU enjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra zebra balık embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice temizleyin.

Orta beyin enfeksiyonu için monte etmek için, agarose içine dört ila altı tricaine-anestezili embriyolar aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Her embriyonun başını 10 kalibrelik bir iğneyle dikkatlice yukarı doğru yerleştirin. Tüm embriyo pozisyonları sabit olduktan sonra, agarose katılaşmak için bir buzkutusu veya soğuk yüzey için cam slayt aktarın.

Orta beyne 500 CFU enjekte edin. Mikroenjeksiyondan sonra zebra balığı embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice yıkayın. Bir kez agarose tamamen katılaşmış, yumurta suyu bir tabaka ile agarose kapağı.

Çevre odası kurduktan sonra, çevre odasına zebra balığı ile 35 milimetrelik cam alt çanak yerleştirin. Açık 405 diyot, argon 20% güç, ve DPSS 561 nanometre lazer. Spektrum ayarlarında uygun lazer gücünü ayarlayın.

XYZ sıralı tetkik edinme modunu seçin ve görüntü biçimini 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Canlı veri moduna geçin, ilk zebra balığının konumunu hedefleyin ve Z’nin başlangıç ve bitiş konumunu işaretleyin. Kalan embriyoların her biri için bu işlemi tekrarlayın.

Programın sonuna bir duraklama ekleyin. Programın döngü ve döngüsünü tanımlayın ve dosyayı kaydedin. Bu çalışmada, makrofajları ve nötrofilleri vivo olarak ayırt etmek için daha önce rapor edilen transgenik coro1a:eGFP;lyzDsRed2 ve transgenik mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP kullanılmıştır.

Bir makrofaj ağır bakteri ile tıkanmış yuvarlak oldu ve azaltılmış hareketlilik görüntülenen, nihai sitoplazmik şişme ile, hücre zarının yırtılması, ve sitoplazmik içeriğin hızlı yayılması. UV ışınlanmış makrofajlar hücre büzülmesi, nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması gibi tipik apoptotik hücre fenotiplerini gösterdi. Ayrıca makrofajların aktif olarak fagositosi ve m.merinum yayıldığı gözlendi.

Ancak, nötrofiller sınırlı fagositik yeteneği vardı, ve hızlı bir şekilde belirgin bakteriyel endolerde olmadan litik hücre ölümü yapıldı. Güçlü gen düzenleme araçları ile birlikte, bu protokol daha fazla vivo konak-patojen etkileşimi üzerinde çeşitli faktörlerin etkisini anlamak için etkili bir platform sağlayabilir.