Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering og analyse av farynle arterier ved hjelp av hele mount immunohistokjemi og 3D rekonstruksjon
Chapters
Summary March 31st, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere og analysere de faryngeale buearteriene 3, 4 og 6 av museembryoer ved hjelp av hele mount immunofluorescens, vevsydding, konfokal mikroskopi og 3D-rekonstruksjon.
Transcript
Denne metoden gjør at hver svelgebue kan komplementeres. Endotelcelletall kan deretter kvantifiseres i hver bue som et middel til å studere svelgeal buearterieutvikling. De viktigste fordelene med denne tilnærmingen er evnen til å visualisere forholdet mellom forskjellige vaskulære strukturer og evnen til kvantitativt å bestemme hvordan strukturene påvirket mutantene.
Aorta bue arterier er ofte mutert i medfødt hjertesykdom. Vår metode gjør det mulig å studere hvordan mutasjoner endrer den fysiologiske prosessen med kardannelse og ombygging. Selv om vi bruker denne metoden for å få innsikt i mekanismene for medfødt hjertesykdom, kan den brukes på andre systemer, spesielt ved bruk av lysarkmikroskopi.
Begynn med å bruke en glasspipette til å overføre hver muse embryonale dag 9,5 eller 10,5 embryo til individuelle to milliliter rør som inneholder en milliliter PBS. Etter fiksering, bruk fine tang for å forsiktig klemme embryoet like over bakkulb og lage et tverrgående kutt for å fjerne den bakre halvdelen av embryoet. For å gjennomsyre embryoene, erstatt PBS med PBST og plasser embryoene på fire grader Celsius med mild agitasjon over natten.
Neste dag erstatter du PBST med 600 mikroliter blokkerer buffer uten å berøre embryoene for en 16 til 18-timers inkubasjon ved fire grader Celsius med mild agitasjon. Neste morgen, erstatte blokkering buffer med 600 mikroliter av det primære antistoffet av interesse per rør for en fire til fem-dagers inkubasjon ved fire grader Celsius med mild agitasjon. På slutten av inkubasjonen, vask embryoene i en milliliter PBST i fire til fem timer med mild agitasjon ved romtemperatur som endrer PBS hver time, etterfulgt av en overnattingsinkubasjon i fersk PBST ved fire grader Celsius og fire til fem ekstra en-timers vasker neste dag.
Etter siste vask, bytt PBST i hvert rør med 600 mikroliter av riktig sekundær antistoffløsning for en fire til fem-dagers inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask embryoene i en milliliter frisk PBST per vask som nettopp demonstrert og bruk en glasspipette til å forsiktig overføre hvert embryo til individuelle plastparafinformer. Fjern forsiktig eventuell PBST fra rundt hvert embryo og orienter hvert embryo i sagittal stilling.
Deretter legger du raskt til ca 500 mikroliter varm agarose til hver form til hvert embryo bare er dekket og legg formene på is dekket med aluminiumsfolie til agarose har størknet. For dehydrering av embryonale prøver, bruk en ren skalpell for å kutte en blokk med agarose rundt hvert embryo og bruk tang for å forstå agarose for overføring til et merket to milliliter rør som inneholder en milliliter 25% metanol. Etter en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket, erstatt 25% metanol med en milliliter 50% metanol per rør for en ekstra en times inkubasjon i mørket.
Etter slutten av dehydrering, erstatte 100% metanol med en milliliter på 50% BABB for en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket. På slutten av inkubasjonen, erstatte 50% BABB med en milliliter på 100% BABB per rør for en times inkubasjon med mild agitasjon i mørket, etterfulgt av en andre inkubasjon med 100% BABB som nettopp demonstrert. For å montere embryoene for avbildning, fjern limet fra en rask støtfanger og plasser støtfangeren på en 24 med seks milliliter nummer 1,5 glassdeksler.
Påfør forsiktig trykk på limet for å fjerne eventuelle luftbobler mellom dekkslipsen og støtfangeren og kast forsiktig 100% BABB fra hvert rør. Bruk deretter fine tang for å forsiktig overføre embryoet til den raske brønnen uten å berøre embryoet og plassere en ekstra dekkslip på støtfangeren. For å overflate endotelet i hele den tredje svelgealbuen, åpne bildet av interesse for programvaren og klikk legg til ny overflate.
Dobbeltklikk overflaten en og endre navn på den nye overflaten til tredje svelgebue. Velg hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt, og sett overflateretningen til YZ-planet. Bruk skiveposisjonen til å plassere det tredje svelgebueoverflaten til der den tredje PAA og dorsal aorta kobles til.
Roter bildet slik at den tredje pharyngeal bue overflaten flyet er i sikte og slå av ortho slicer. Under tegnekonturmodus velger du funksjonen for avstandstegningsmodus og justerer parameterinnstillingene etter behov. Når alle parameterne er angitt, trykker du escape-tasten og klikker tegne for å spore omkretsen av den tredje svelgealbuen med musepekeren.
Bruk deretter skiveposisjonen til å flytte 10 til 25 skiver og spore omkretsen av svelgealbuen. Når hele buen er sporet, klikker du opprett overflate for å generere overflaten av det sporede området. Velg maskevalg for den tredje PAA- og DAPI-en i redigeringsmenyen for maskering av de viste strukturene, og klikk OK. Deretter gi nytt navn til den nye kanalen som PAA DAPI.
Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Hvis du vil visualisere endotelplexus separat fra PAA, velger du maskevalg for den tredje PAA-en og velger DAPI. Fjern merket for velg voxels utenfor overflaten til og sjekk velg voxels inne overflaten til.
Sett velg voxels i overflaten til null, og klikk OK. Gi nytt navn til den nye kanalen som ikke-PAA DAPI. Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Velg maskevalg for den tredje PA, velg ikke-PAA DAPI, og klikk OK. Gi nytt navn til den nye kanalen som plexus DAPI.
Gjenta dette trinnet for de gjenværende kanalene. Hvis du vil kvantifisere de enkelte endotelcellene i hver interessestruktur, slår du av alle kanalene unntatt PAA ERG-kanalen i skjermjusteringspanelet. Klikk Legg til nye flekker på Egenskaper-menyen, og klikk for å gi nytt navn til flekker én PAA totalt antall endotelceller.
Klikk på den blå pilen, og velg PAA ERG-kanalen for kildekanalen. Juster den estimerte XY-diameteren til fire mikrometer, og klikk på den blå pilen for å gå videre til neste panel. Bruk glideskalaen til å justere antall flekker for å sikre at hver ERG-positiv endotelcellekjerne er representert med ett sted.
Deretter klikker du på den grønne doble pilen og slår av PAA ERG-kanalen i skjermjusteringspanelet. Slå på PAA VEGFR2-kanalen for å visualisere PAA endotelet, og klikk rediger og legg til / slett for å velge overflaten av objektet. Trykk deretter Escape og hold nede Skift for å slette eventuelle flekker som ikke er VEGFR2-positive, og klikk kategorien statistikk for å bestemme totalt antall endotelceller.
Hele mount immunofluorescence gir klare og rene resultater slik at 3D rekonstruksjon av svelget bue endotel. I dette bildet er tilstedeværelsen av de store lyse prikkene et resultat av partikler i enten antistoffet eller blokkerer bufferløsninger. Etter svelgbue og PAA overflatefarging, gjør bruk av maskefunksjonen at de overflateområdene kan separeres og uavhengig analyseres.
Maskering tillater også individuell analyse og kvantifisering av endotelcellenumre i hver struktur. For eksempel, her spotfunksjonen ble brukt til å kvantifisere det totale antall endotelceller i både PAA og plexus ved å tildele et enkelt sted for hver kjerne som uttrykker ERG. I dette bildet kan et ERG-positivt VEGFR2 negativt sted som er generert av spotfunksjonen observeres.
Derfor er det viktig å kontrollere at hver prikk gjenkjent av programvaren faktisk representerer en enkelt endotelcelle. For å få rene og klare bilder, husk å spinne ned alle løsningene og til riktig og grundig vaske hvert embryo etter antistoff inkubasjoner. Det er viktig å huske at BABB er etsende og giftig.
Håndter og kast oppløsningsvæsken riktig og sørg for å forsegle de smeltede embryoene helt for å forhindre BABB-lekkasje.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
