Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Deze methode maakt het mogelijk om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A eiwit te identificeren. Het kan ook worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tests en andere eiwitten. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat het kan worden gebruikt om EYFP CENP-A K124R alomtegenwoordige sites met een cruciale biologische betekenis te identificeren.

Het zou kunnen worden uitgebreid om de post-translationele wijzigingen van een breed scala aan functionele eiwitten te onderzoeken. Begin met het bereiden van eiwit Een kralen gebonden met anti-GFP antilichaam. Was 25 microliter eiwit Een kralen per immunoprecipitatiereactie met buffer A1 ten minste drie keer om de ethanol te verwijderen.

Maak dan een 50% kraal oplossing met buffer A1. Voeg twee microliter anti-GFP antilichaam toe aan de kralen. Voeg vervolgens buffer A1 toe tot 20 keer het netto kraalvolume. Voer end-to-end rotatie uit bij vier graden Celsius gedurende vier tot 18 uur.

De optimale duur van de rotatie moet empirisch worden bepaald op basis van de efficiëntie van de immunoprecipitatie. Na de rotatie, centrifugeren de kralen op 100 keer g gedurende een minuut en verwijder de niet-gebonden supernatant. Voeg buffer A1 toe om een 50%-oplossing van kralen te maken en gebruik 25 microliter van deze oplossing voor elke immunoprecipitatiereactie.

Om de immunoprecipitatie uit te voeren, lyse cellen in buffer A1 via sonicatie en vries/dooi. Meet eiwitconcentraties en normaliseer de eiwithoeveelheden tussen de verschillende IP-monsters. Verwijder vervolgens 5% van het monster uit elke buis om op de SDS-pagina uit te voeren.

Meng de rest van het lysaat met 25 microliter eiwit Een kralen gebonden aan anti-GFP-antilichaam en voer end-to-end rotatie uit bij vier graden Celsius gedurende vier tot 18 uur. Na het lysing van cellen in buffer A en het uitvoeren van immunoprecipitatie zoals eerder beschreven, houdt u 10% van de totale immunoprecipitanten om EYFP CENP-A-a.-100 te hebben uitgevoerd en de positie van de eerder beschreven EYFP CENP-A nauwkeurig te bepalen. Gebruik de andere 90%voor massaspectrometrie analyse.

Voer het massaspectrometriemonster uit in een commercieel verkrijgbaar 4-12%Bis-Tris eiwitgel. Voer vervolgens Coomassie blauwe vlekken en accijns de 50-70 kilodalton gel regio voor massa spectrometrie analyse. Snijd elke gel in kleine stukjes en leg ze in een 0,5 milliliter laag eiwitarme bindingsbuis.

Was de gelstukken met 100 microliter van 50%acetonitril in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat. Vortex ze voor 10-15 minuten. Draai ze dan naar beneden en gooi de supernatant weg.

Na de laatste wasbeurt, droog de gel stukken met een bank top vacuüm concentrator voor 30 minuten. Voeg 10 microliter van 10 nanogram per microliter sequencing grade trypsine toe en laat de gelstukken vijf minuten hydrateren. Voeg vervolgens 25 millimolar ammoniumbicarbonaat toe, net genoeg om de gelstukken te bedekken en ze ‘s nachts te verteren bij 37 graden Celsius.

Breng de verteerde supernatant op de volgende dag over in een schone siliconen buis van 0,65 milliliter en voeg 50%acetonitril en 5%mierenzuuroplossing toe. Vortex het monster gedurende 10 minuten. Draai het dan naar beneden en breng de supernatant in een extractiebuis.

Concentreer het monster opnieuw op twee microliters. Voeg vervolgens acht microliters van 3%acetonitril en 2%mierenzuuroplossing toe. Vortex gedurende 15 minuten en draai het naar beneden op 16.000 keer g gedurende 30 minuten.

Ms-gegevensverwerving uitvoeren met LC-MS/MS met behulp van een vloeibaar chromatografiesysteem in combinatie met een massaspectrometrie-instrument. Injecteer acht microliter van het monster in een omgekeerde fase vloeibare chromatografiekolom en scheid de peptiden met een 2-80% gradiënt van oplosmiddel B in 60 minuten na manuscriptaanwijzingen. Verzamel massaspectrometriegegevens met behulp van de gegevensafhankelijke acquisitiemodus.

Open de commerciële software om massaspectrometriegegevens op het bureaublad te analyseren. Als u een nieuwe zoekopdracht wilt starten, klikt u op de KNOP LC in het bovenste menu. Klik vervolgens op de knop Toevoegen om de oorspronkelijke MS-onbewerkte gegevensbestanden te uploaden.

Selecteer human protein ID in de paragon methode als de database zoekmethode en zoek de originele MS raw data bestanden tegen de UniProt homo sapiens database. Selecteer trypsine als spijsverteringsenzym en stel de rest van de parameters in op basis van de routebeschrijving van het manuscript. Voer de bestandsnaam resultaten in en klik op de knop Opslaan als rechts van het menu.

Selecteer vervolgens een map voor het opslaan van de zoekresultaten en klik op de knop Opslaan. Klik op de procesknop om de zoekopdracht te starten. Nadat de zoekopdracht is beëindigd, worden gegevens met de ingevoerde zoeknaam automatisch opgeslagen in de geselecteerde map.

Om MS/MS spectra van een specifiek peptide te verkrijgen, opent u de zoekresultaten in software F.Klik vervolgens op het eiwit in de eiwitlijst in het bovenste menu en klik op het peptide in het middelste menu. De MS/MS van dit peptide verschijnt onderaan het menu. Als u de MS/MS-spectra wilt exporteren en opslaan, kopieert u de spectra en plakt u deze naar een geschikte bestandsindeling.

Genconstructies van EYFP CENP-A wild type of K124R mutant die het verlies van endogene CENP-A redt werden stabiel uitgedrukt toen retrovirale integratie werd uitgevoerd. De expressie van endogene CENP-A werd niet gedetecteerd zeven dagen na de inductie van Cre recombinase. Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R eiwit expressie bleek te zijn op een vergelijkbaar niveau als de eerste endogene CENP-A eiwit.

Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R mutanten toonden centromere lokalisatie op zeven dagen na de verstoring van de resterende expressie van endogene CENP-A. De EYFP CENP-A wild type en de K124R mutant toonde alomtegenwoordigheid en interactie met HJURP in tegenstelling tot het geval voor gemarkeerde gelabelde of niet-gelabelde CENP-A wild type en de K124R mutant. De levensvatbaarheid van de cel werd beoordeeld door de uitgroeitest van de kolonie 14 dagen na de verstoring van het resterende endogene CENP-A-allel uit te voeren.

Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R mutanten toonde een vergelijkbaar aantal geredde kolonies 14 dagen na de verstoring van de resterende endogene CENP-A allel. IP massaspectrometrie bleek alomtegenwoordigheid bij lysine 306 in EYFP CENP-A K124R in CENP-A minus F cellen. Alles bij elkaar, deze resultaten suggereerden dat de fusie van grote grootte eiwit induceert alomtegenwoordigheid op een andere lysine dan K124R in CENP-A die de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype remt.

Wanneer u dit protocol probeert, gebruikt u de commercieel beschikbare 4%12%Bis-Tris eiwitgels om de massaspectrometriemonsters uit te voeren. Voeg voldoende trypsine aan de gel stukken en hydrateren totdat alle enzymen zijn geabsorbeerd. Lager moleculair gewicht tagging of indringende techniek is eigenlijk nodig om alomtegenwoordigheid te visualiseren en te onderzoeken ruimtelijke temporele eiwit alomtegenwoordigheid signalering op de en hele organisme niveaus.