Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Summary

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Abstract

Het bestuderen van de structuur en de dynamiek van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosomale instabiliteit (CIN) en kankerprogressie. Hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie is een fundamentele vraag. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.

Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren, wat suggereert dat alomtegenwoordigheid bij een andere lysine wordt veroorzaakt door de EYFP-tagging in het CENP-A K124R gemuteerd eiwit. Lysine 306 (K306) alomtegenwoordigheid in EYFP-CENP-A K124R werd met succes geïdentificeerd, wat overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrie analyse. Een voorbehoud wordt besproken in het gebruik van GFP /EYFP of het taggen van eiwit met een hoog moleculair gewicht als hulpmiddel om de functie van een eiwit te analyseren. Huidige technische limiet wordt ook besproken voor de detectie van alomquitylated banden, identificatie van site-specifieke alomtegenwoordigheid(en), en visualisatie van alomtegenwoordigheid in levende cellen of een specifieke eencellige cel tijdens de hele celcyclus.

De methode van massaspectrometrie analyse hier gepresenteerd kan worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore eiwitten. Deze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests / analyses kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid.

Introduction

In de meeste eukaryoten moeten spindelmicrotubuli zich hechten aan één enkel gebied van elk chromosoom, centromere genoemd. De kinetochore is een complex van eiwitten die zich op de centromere bevinden. Het bestuderen van de timing van centromere en kinetochore eiwit bewegingen en de structuur van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosoom instabiliteit (CIN) en kanker progressie. De belangrijkste vragen zijn hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en hoe ze deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie. In de meeste soorten, de aanwezigheid van een speciaal nucleosoom met een specifieke histone-achtige eiwit genaamd CENP-A definieert de centromere identiteit. Daarom wordt voorgesteld dat CENP-A de niet-DNA-indicator (epigenetisch merk) van centromere identiteit is. Het is belangrijk om het mechanisme op te helderen van hoe CENP-A de centromere identiteit bij mensen definieert.

De Holliday junction recognition protein (HJURP) is de CENP-A-specifieke chaperon die CENP-A in centromerische nucleosomen^1,2,3deponeert . We have previously reported that the CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase is required for CENP-A ubiquitylation on lysine 124 (K124) and centromere localization⁴. Ook onze resultaten toonden aan dat de centromere werving van nieuw gesynthetiseerde CENP-A vereist reeds bestaande ubiquitylated CENP-A⁵. Thus, a model was provided suggesting that CENP-A ubiquitylation is inherited through dimerization between cell divisions.

In tegenstelling tot onze bevindingen en die van Yu et al., werden de negatieve resultaten betreffende CENP-A en zijn centromeric lokalisatie onlangs gepubliceerd⁶. Het artikel beweerde dat CENP-A wijzigingen op lysine 124 (K124) zijn onmisbaar voor de oprichting, onderhoud, en de functie op lange termijn van de menselijke centromeres, op basis van hun negatieve resultaten waaruit blijkt dat de mutatie van K124R niet van invloed CENP-A centromere lokalisatie noch cel levensvatbaarheid⁶. Er is echter voldoende ruimte voor discussie in hun resultaten en conclusies, en we hebben al beschreven welk probleem er zou kunnen zijn in hun vorige publicatie⁷. Er moet op worden gelet dat ze eiwitten hebben versmolten met CENP-A, die veel grotere moleculaire gewichten hebben dan de grootte van endogene CENP-A: bijvoorbeeld, ze gesmolten ~ 30 kDa verbeterde gele fluorescente eiwitten (EYFP) tot ~ 16 kDa CENP-A en analyseerde EYFP-CENP-A K124R fusie eiwit in hun RPE-1 CENP-A^-/F knock-out systeem. K124 ubiquitine zal naar verwachting niet rechtstreeks binden aan HJURP op basis van structurele voorspellingen^4,maar de toevoeging van mono-ubiquitine zal naar verwachting een impact hebben op de eiwitcontenschap van CENP-A. Het eiwit van CENP-A-conformatie kan worden veranderd door de aanwezigheid van een groot fusie-eiwit, en deze conformatieverandering kan de structurele veranderingen maskeren die worden veroorzaakt door het verlies van alomtegenwoordigheid. Wij stellen voor dat de fusie van groot-en klein-grote eiwit alome alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt / maskeert de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype. Bewijs dat alomtegenwoordigheid optreedt bij verschillende lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit met een large tag eiwit (EYFP) werd gemeld in onze vorige publicatie⁸. Er werd vastgesteld dat EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert van een andere lysinesite van EYFP-CENP-A K124R en dat EYFP-CENP-A K124R mutant bindt aan HJURP. Als gevolg hiervan remt/maskeert deze alomtegenwoordigheid op een andere locatie het oorspronkelijke K124R enkel mutantene fenotype, en zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden centromere lokalisatie (we gebruikten en vergeleken pBabe-EYFP-CENP-A WT en K124R mutant, samen met pBabe-EYFP control.). The results demonstrated that Flag-tagged or untagged CENP-A K124R mutants are lethal but can be rescued by a monoubiquitin fusion, suggesting that CENP-A ubiquitylation is indispensable to cell viability.

In de afgelopen jaren hebben veel studies verschillende tests ontwikkeld om posttranslationele modificaties (PTMs) van CENP-A-eiwit en andere centromere-kinetochore-eiwitten te identificeren, zowel in vivo als in vitro^9,10,11. Analoog aan de PTMs van histoneiwitten die een belangrijk mechanisme zijn dat de functie van chromatine regelt, zijn PTMs van centromerische chromatinecomponenten ook betrokken bij een essentieel mechanisme om de algehele structuur en functie van centromeres te reguleren. De meeste CENP-A PTM-sites zijn specifiek voor CENP-A-bevattende nucleosomen, hoewel een paar daarvan in histone H3 worden bewaard, wat suggereert dat wijziging van deze residuen bijdraagt aan de centromere-specifieke functie. PTMs van CENP-A met inbegrip van fosforylatie, acetylatie, methylatie, en alomtegenwoordigheid werden eerder gemeld⁹, wat suggereert dat CENP-A wordt onderworpen aan een verscheidenheid van PTM's en hun combinatorische arrays op zijn amino terminus en C-terminus histone-fold domein. Het belang van CENP-A wijzigingen in meerdere functies werd onthuld door vele groepen, waaronder de onze. Deze functies omvatten CENP-A depositie bij centromeres, eiwitstabiliteit en rekrutering van het CCAN (constitutief centromere-geassocieerd netwerk)⁹. Beperkte studies en bevindingen van CENP-A PTM's zijn echter voorgevormd wanneer vergelijkingen worden gemaakt met een van canonieke histonen die hun functie direct of indirect reguleren. Technische rapporten die zich richten op de methodologie om deze CENP-A PTMs te identificeren zijn ook beperkt.

Because CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere¹², inherited through dimerization between cell division⁵, and indispensable to cell viability⁸, the method to identify CENP-A ubiquitylation would be essential in future to study the functional activity, positioning, and structure of the centromere. Daarom beschrijven we hier massaspectrometrie-analyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R-mutant te identificeren, wat suggereert dat de EYFP-tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in het CENP-A K124R gemuteerde eiwit⁸. Protocollen van andere controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) worden ook gepresenteerd om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken.

Protocol

1. Celcultuur en retrovirustransfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructies

OPMERKING: EYFP-CENP-A wordt uitgedrukt uit pBabe-EYFP-CENP-A op een vergelijkbaar eiwitniveau als endogene CENP-A. Totaal cellulair CENP-A eiwit wordt vervangen door dit EYFP-CENP-A na de verstoring van het CENP-A^-/F allel door Cre recombinase zoals in RPE-1 CENP-A-/- cellen⁶.

1. Bereiding van het supernatant dat retrovirus bevat met behulp van 293T verpakkingscellen.
   1. Dag 0: Spread 293T verpakkingscellen op de 6-well kweekplaat (1,0 x 10⁶ cellen/put). Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
   2. Dag 1: Bereid de transfectiereactie rond 23 uur na verspreiding (24 uur punt is 0 h punt van de transfectie). Transfect expression plasmid van elke pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) en pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (zie tabel 1).
   3. Kies een combinatie van helper/verpakkingsplasmids vermeld in tabel 2 en voeg ze toe aan buizen met een van de hierboven genoemde plasmiden. Er zijn meestal deze 3 combinaties voor helper /verpakking plasmiden (Tabel 2). Elke combinatie werkte in deze experimenten en toonde een vergelijkbare transfectie efficiëntie.
   4. Bereid 50 μL verlaagd serummedium en meng 2,0 μg van elke pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 1), en pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (zie tabel 1) waarbij één combinatie van helper/verpakkingsplasmids wordt toegevoegd die in tabel 2 is vermeld (zie hieronder). Broed dit mengsel 5 min op kamertemperatuur. Dit mengsel is oplossing A.
   5. Bereid nog eens 50 μL verlaagd serummedium en meng respectievelijk 1,5 μL transfectiereagentia I en II (Tabel van materialen). Broed dit mengsel 5 min op kamertemperatuur. Dit mengsel is oplossing B.
      OPMERKING: Voeg eventueel slechts 6,0 μL transfection reagens III (polyethyleenimine [PEI]; 1,0 mg/mL) toe in oplossing B of voeg 6,0 μL transfection reagens III toe naast transfection reagentia I en II in oplossing B (Tabel van materialen).
   6. Mix oplossingen A en B samen en broed 15 minuten op kamertemperatuur.
   7. Na het wassen van de gekweekte cellen eenmaal met PBS, voeg het mengsel van oplossingen A en B (d.w.z., DNA-lipide complex) direct aan elke put van de 6-well kweekplaat toe die 500 μL verminderd serummiddel heeft. De uiteindelijke concentratie van het plasmide is 3,3 μg/mL.
   8. Na het uitbroeden van de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 4,5 uur, verander je de medium tot high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Zet 2 mL/goed van cultuurmiddel na de middelgrote verandering in de 6-goed cultuurplaat.
   9. Kweek de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 48 uur na transfectie. Voer retrovirus infectie uit op dag 3 met behulp van de supernatant met retrovirus.
2. Retrovirusinfectie van CENP-A^-/F RPE-1 doelcellen.
   1. Dag 2: Een dag voor infectie, verspreid CENP-A^-/F RPE-1 doelcellen te transfecteren in de 6-well cultuur goed (2,25 x 10⁵ cellen / goed). Kweekcellen in DMEM: F12 medium (Tabel van materialen) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
      OPMERKING: Spread cellen voor kolonie uitgroei testen, immunofluorescentie, en westerse vlek analyse als controle. Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
   2. Dag 3 (infectiedag van het virus): Bij 48 uur na transfectie van 293T verpakkingscellen verzamel je het supernatant met virus en filter door 0,45 μm filter (gebruik geen 0,2 μm filter dat virusenvelop zal afschuinen). Het wordt aanbevolen om polyethersulfone (PES) filters te gebruiken.
   3. Infecteer CENP-A^-/F RPE-1 cellen met het virus. Voor een put van de 6-well kweekplaat, voeg 1 mL verse media, 1 mL virus supernatant en polybrene aan een uiteindelijke concentratie van 8 μg/mL. Incubeer CENP-A^-/F RPE-1 cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 4 dagen tot dag 7 na transfectie.
      OPMERKING: De incubatietijd voor CENP-A^-/F RPE-1 celgroei moet empirisch worden bepaald door analyses te volgen voor optimale resultaten.

2. Immunofluorescentieanalyse van cellen die pBabe-EYFP-CENP-A bevatten

1. Dag 7: 4 dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs, verwijder de cultuur medium door aspiratie. Spoel cellen één keer met TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Breng tbs aan op de zijkant van de cultuurputten om te voorkomen dat het oppervlak van cellen wordt verstoord.
   LET OP: Het optimale tijdspunt voor celfixatie moet empirisch worden bepaald. Immunofluorescentie signalen van zowel EYFP-CENP-A WT en K124R zijn detecteerbaar op de centromere ten minste 4 dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructies zelfs zonder Cre infectie (gegevens niet getoond, Figuur 1C-E voor de gegevens met Cre infectie).
2. Voer methanolcelfixatie en immunofluorescentievlekken uit zoals eerder beschreven¹³.
3. Als primaire antilichamen gebruik maken van een anti-GFP-antilichaam (1:1,000 verdunning) en een anti-CENP-B-antilichaam (verdunningsverhouding van 1:200) voor een centromere locatiemarker in TBS met 4% geitenserum (zie Tabel van Materialen voor gebruikte antilichamen).
4. Verwijder overtollig montagemedium met een papieren handdoek en sluit de randen van de coverslip af met nagellak bij de laatste stap.
5. Raadpleeg de eerder beschreven methode¹³ voor immunofluorescentiebeeldobservatie, verwerving, kwantificering en analyse van resterende signalen van EYFP-CENP-A bij de centromere.
6. Beeldacquisitie, verwerking uitvoeren, inclusief deconvolutie, kwantificering en analyse met behulp van Softwares A of Software B1 en B2 (zie Tabel met materialen). Gebruik optioneel Softwares C1-C3 (zie Tabel van Materialen)voor een confocale laserscanmicroscoop.
   OPMERKING: Zie 2.6.1 in aanvullende coderingsbestanden voor alle opdrachten die worden gebruikt in Software A. Zie 2.6.2 in aanvullende codeerbestanden voor alle opdrachten die worden gebruikt in software B1 en B2.

3. Kolonie uitgroei testen met behulp van pBabe-EYFP-CENP-A na retro-Cre virus infectie

OPMERKING: De reden voor het uitvoeren van deze test is het vergelijken van de cel levensvatbaarheid tussen EYFP-CENP-A WT en K124R mutant na de verstoring van de CENP-A^-/F allel door Cre recombinase (na de vervanging van de totale cellulaire CENP-A eiwit).

1. Retrovirus transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs.
   1. Uitvoeren retrovirus transfectie van CENP-A^-/F RPE-1 cellen zoals beschreven in sectie 1. Kweekcellen in DMEM: F12 medium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine voor 72 uur na de virusinfectie.
   2. Drie dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs (op dag 6), voeg blasticidin S (10 μg/mL) in putten met transfected cellen worden gebruikt voor kolonie uitgroei test en controle-experimenten. Cellen worden ten minste 14 dagen na virusinfectie gekweekt in aanwezigheid van blasticidin S. Verander het medium dat blasticidin S elke 5 dagen bevat.
      OPMERKING: Als cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken voordat ze voor de kolonietest zaaien (3.2.7. en 3.2.8), doorsnee de cellen op 1:2 en 1:5 verhouding door trypsinisatie en beplating in een 6 goed kweekplaat.
   3. Verzamel cellen voor westerse vlek op dag 7 om de eiwitexpressie van pBabe-EYFP-CENP-A constructen zonder Cre-infectie te bevestigen. Voer westerse vlekanalyse uit zoals beschreven in sectie 4. De resultaten zijn te zien in figuur 1B (rijstroken 1-4).
   4. Voor kolonie uitgroei test met Cre virus infectie, houden de cellen groeien gedurende 14 dagen na de virusinfectie in aanwezigheid van blasticidin S (dat wil zeggen, groeien cellen in blasticidin S met medium tot dag 17 voor de resultaten hier gepresenteerd).
2. Retro-Cre virusinfectie van pBabe-puro-Cre
   LET OP: Dag 0 in stap 3.2.1 komt overeen met dag 13 van punt 3.1.
   1. Dag 0 tot en met dag 3: Voer retrovirustransfectie uit van CENP-A^-/F RPE-1 cellen met pBabe-puro-Cre (B3027) als expressieplasmid (zie sectie 1 voor meer informatie). Zorg ervoor dat blasticidin S (10 μg/mL) wordt toegevoegd in het kweekmedium.
   2. Dag 4: Probeer cellen te scheiden van de plaat. Plaat 500 of 5.000 cellen in drievoud in de 6-put kweekplaat. Kweekcellen in DMEM: F12 medium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
   3. Dag 5: Voeg blasticidin S (10 μg/mL) toe aan het kweekmedium. Voor de beplating van 5.000 of 500 cellen, selecteer cellen met blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dagen (tot dag 14 in [3.2.7]) of 3-28 dagen (tot dag 18 in [3.2.8]) na virusinfectie van constructies (pBabe-EYFP-CENP-A constructen).
      OPMERKING: In deze kolonie uitgroeitest wordt de transfectie van pBabe-puro-Cre toegevoegd, samen met de transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A. De transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A wordt uitgevoerd in 3.1. De transfectie van pBabe-puro-Cre wordt uitgevoerd in 3.2.1.
   4. Dag 10 (7 dagen na retro-Cre virusinfectie): Verzamel cellen voor westerse blotting-analyse om eiwituitputting van endogene CENP-A te bevestigen na retro-Cre-virusinfectie en/of eiwitexpressie van pBabe-EYFP-CENP-A construeert op dezelfde dag 10.
   5. Voer western blotting uit zoals beschreven in sectie 4 op dezelfde dag 10. De resultaten worden weergegeven in figuur 1B (rijstroken 5-7).
   6. Voer immunofluorescentieanalyse uit (punt 2 hierboven) om te bevestigen dat zowel EYFP-CENP-A WT als K124R 7 dagen na inactivatie van het resterende endogene CENP-A-allel zijn gelokaliseerd op de centromere. De resultaten worden weergegeven in figuur 1C-1E.
   7. Dag 14: Voer de kolonie uitgroei test met de plaat gezaaid met 5.000 cellen. Fix cellen voor 10 min in methanol en vlek gedurende 10 min in een kristal violet oplossing (2,3% kristal violet, 0,1% ammoniumoxalaat, 20% ethanol (zie figuur 2B). Tel het aantal kolonies met de OpenCFU-software (zie figuur 2C).
   8. Dag 18: Gebruik de plaat gezaaid met 500 cellen. Fix en vlekcellen zoals beschreven in stap 3.2.7 (zie figuur 2B). Tel het aantal kolonies (zie figuur 2C).

4. Westerse vlekanalyse met pBabe-EYFP-CENP-A

OPMERKING: Raadpleeg de eerder beschreven methode¹³ voor westerse vlekanalyse met behulp van antilichamen die zijn aangegeven in figuur 1B en figuur 2A en tabel van materialen voor EYFP-CENP-A-eiwitten.

1. Isoleer eiwitten door de cellen te lyseren die met verschillende virusinfectie worden gekweekt. Gebruik vervolgens 20 μg eiwit in één put van SDS PAGE gel. Breng de eiwitten over op een PVDF-membraan zoals eerder beschreven¹³.
2. Was het membraan 3x na incubaties met primaire secundaire antilichamen. Detecteer en analyseer de eiwitbanden op het membraan met het infraroodbeeldvormingssysteem en/of de chemiluminescentie imager voor immunoblot detectie. Deze resultaten worden weergegeven in figuur 1B en figuur 2A.
   1. Zie stap 4.2.1 in aanvullende coderingsbestandenvoor het infraroodbeeldsysteem om de eiwitbanden te detecteren en te analyseren.
   2. Gebruik de chemiluminescence imager om de eiwitbanden te detecteren en te analyseren, zie stap 4.2.2 in aanvullende coderingsbestanden. Gebruik voor dit systeem een ultragevoelig verbeterd chemiluminescent (ECL) substraat(Tabel van materialen).
   3. Optioneel, gebruik westerse vlek strippen buffer uit te strippen pre-geïncubeerde antilichamen uit de PVDF membraan en reblot het met verschillende antilichamen voor de volgende draai van de westerse analyse. Empirisch bepalen de geoptimaliseerde incubatietijd en temperatuur te gebruiken.

5. Celcultuur, transfectie en in vivo alomtegenwoordigheidstesten met pQCXIP-EYFP-CENP-A

OPMERKING: Het eiwitniveau van EYFP-CENP-A uitgedrukt uit pQCXIP-vector is ~ 10x hoger dan het endogene CENP-A eiwitniveau. Het gebruik van deze vector vergemakkelijkt immunoprecipitatie van een hogere hoeveelheid van de EYFP-CENP-A eiwitten, observatie van de alomtegenwoordige banden van EYFP-CENP-A, en identificatie van de alomtegenwoordigelrilling van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit door middel van massaspectrometrie analyse.

1. Transfectie voor in vivo alomtegenwoordigheidstesten met behulp van pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Zaad 36,2 x 10⁵ CENP-A^-/F RPE-1 cellen in een 10 cm weefselkweekschotel. Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te worden gebruikt bij het zaaien. Bereid ten minste 2 gerechten voor een immunoprecipitatie (IP) monster om een minimum van 1 mg totale eiwit te verkrijgen.
   2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 18 uur.
   3. Om 17 uur na het zaaien, bereid de transfectie reagentia.
   4. Maak oplossing A door 6,7 μg plasmide van elke pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tabel 1)in 335 μL van gereduceerd serummedium, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 6,7 μg plasmide pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) toe aan alle monsters.
      OPMERKING: Alle vectoren staan vermeld in tabel 1.
   5. Maak oplossing B door 10,1 μL transfectiereagentia I en II te mengen, respectievelijk in 335 μL verlaagd serummedium, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
      OPMERKING: Een optionele stap is om slechts 40,2 μL transfection reagens III (polyethyleenimine [PEI]; 1,0 mg/mL) toe te voegen aan oplossing B of 40,2 μL-transfectiereagens III toe te voegen naast transfectiereagentia I en II in oplossing B (Tabel van materialen).
   6. Mix oplossingen A en B samen en broed 15 minuten op kamertemperatuur.
   7. Na het wassen van de gekweekte cellen eenmaal met PBS, voeg het mengsel van oplossingen A en B (d.w.z. DNA-lipide complex) rechtstreeks aan elk van de individuele 10 cm weefselkweek schotel die 3.35 mL μL verminderd serummedium heeft.
      LET OP: De uiteindelijke concentratie is 1,67 μg/mL plasmide.
   8. Incubeer de cellen bij 37 °C incubator met 5% CO₂ voor 4,5 uur. Na 4,5 uur wijzigt u de medium tot high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
   9. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur na transfectie. Verzamel cellen voor de voorbereiding van cellenlysates.
2. Bereiding van eiwit Een kralen gebonden met anti-GFP antilichaam.
   1. Neem 25 μL (50% v/v) eiwit Een kralen voor één reactie van immunoprecipitatie (IP). Wassen met buffer A1(Tabel van materialen) ten minste 3x om EtOH te verwijderen, en maak 50% oplossing met buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholaat; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-vrije proteas inhibitor reageage).
   2. Voeg 2,0 μL anti-GFP-antilichaam (Anti#76: Homemade antilichaam) toe aan de parels die hierboven zijn bereid en voeg 10x volume buffer A1 toe in vergelijking met het netto kralenvolume.
   3. Voer end-to-end rotatie uit bij 4 °C voor 4-18 uur. De optimale tijdsduur voor end-to-end rotatie moet empirisch worden bepaald op basis van de efficiëntie van de immunoprecipitatie.
   4. Centrifuge de kralen op 100 x g gedurende 1 min en verwijder de ongebonden supernatant. Voeg buffer A1 toe om opnieuw een 50% (v/v) oplossing van de kralen te maken. Gebruik 25 μL (50% v/v) van deze oplossing voor één reactie van IP.
3. Immunoprecipitatie (IP) met eiwit Een sepharose kralen gebonden met anti-GFP antilichaam.
   1. Lyse cellen verkregen in stap 5.1.9 in buffer A1 door sonicatie en vries-dooi proces.
   2. Meet eiwitconcentraties en normaliseer eiwithoeveelheden tussen verschillende IP-monsters. Verwijder 5% van het monster uit elke buis om te worden uitgevoerd als 5% invoermonster in SDS-PAGE.
      OPMERKING: Het 5% inputmonster kan worden ingevroren in vloeibare stikstof en bij -80 °C worden opgeslagen, als het niet binnen een dag wordt geladen.
   3. Meng de rest van 95% lysaat met 25 μL (50% v/v) eiwit Een kralen gebonden aan anti-GFP-antilichaam dat in stap 5.2 werd bereid. Voer end-to-end rotatie uit bij 4 °C voor 4-18 uur.
      LET OP: De optimale tijdsduur voor end-to-end rotatie moet empirisch worden bepaald.
   4. Centrifuge-eiwit Een kralen met het eiwit eraan gebonden (d.w.z. immunoprecipitaten) met 100 x g gedurende 1 min, en verwijder de supernatant. Was de immunoprecipitaten met buffer A1 door 100 x g gedurende 1 min te centrifugeren. Voer deze stap 4x uit.
   5. Meng de 5% Input en de rest van 95% immunoprecipitaten met respectievelijk 2x en 4x SDS-PAGE laadbuffer^14. Kook deze twee monsters gedurende 5 minuten en laad ze vervolgens op een 10,0% denaturerende SDS-polyacrylamide gel voor elektroforese in verschillende rijstroken. Gebruik grotere SDS-PAGE gel (bijvoorbeeld 17 cm x 15 cm) voor elektroforese. Als monsters worden uitgevoerd in kleinere gel, is het mogelijk niet mogelijk om duidelijke / scherpe alomtegenwoordigheid banden te observeren.
   6. Voer westerse vlekanalyse uit zoals beschreven in punt 4 met behulp van de antilichamen die in het vorige rapport zijn vermeld⁸. Het resultaat wordt weergegeven in figuur 2A.
   7. Gebruik de westelijke vlek strippen buffer te strippen uit de pre-geïncubeerde antilichamen uit de PVDF membraan en reblot het met verschillende antilichamen voor de volgende ronde van de westelijke vlek analyse.

6. Massaspectrometrie om de alomtegenwoordigheidsplaats van de EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren

1. Transfectie voor massaspectrometrieanalyse met pQCXIP-EYFP-CENP-A.
   1. Zaad CENP-A^-/F RPE-1 cellen in een 10 cm weefselkweekschotel. Controleer of de celdichtheid 36,2 x 10⁵ cellen per schaal is. Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Bereid ten minste 20 gerechten voor één immunoprecipitatiemonster (IP), om ten minste 10 mg totaal eiwit te verkrijgen (zie 5.3).
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
   2. Broed de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ voor 18 uur. Bereid de transfectiereagentia ~ 23 uur na verspreiding voor (24 uur punt is 0 h punt van de transfectie).
   3. Bereid om 17 uur na het zaaien de transfectiereagentia en transfecte cellen voor als (4.1.3). Transfected cellen hebben pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) en pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
   4. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ gedurende 48 uur na transfectie. Verzamel cellen voor cellysates.
   5. Lysecellen in buffer A1 en voeren immunoprecipitatie uit als (5.2) en (5.3). Voer deze twee immunoprecipitatie lysates uit als volgt (6.1.6) en (6.1.7).
      OPMERKING: Voer het monster in (6.1.6) uit in standaard Tris-glycinegels. Voer in (6.1.7) het monster uit in de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels. Zie ook Discussie.
   6. Keep one sample for 10% of total immunoprecipitants to confirm EYFP-CENP-A ubiquitylation and to precisely determine the position of ubiquitinated EYFP-CENP-A as described in section 5. Voer dit monster uit in standaard Tris-glycine gels. SDS-PAGE en western vlek werden uitgevoerd als (5.3).
   7. Bewaar nog een monster voor 90% van de totale immunoprecipitanten voor massaspectrometrieanalyse. Voer dit monster uit in twee putten van de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels. Voer Coomassie blauwe vlekken uit met behulp van Coomassie blauwe oplossing. Accijnzen en uitsnijden van de gel regio van 50-70 kDa (putative mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R regio). Gebruik deze gel regio voor massaspectrometrie analyse.
2. Massaspectrometrie analyse met behulp van in-gel spijsvertering.
   1. Snijd elk gelschijfje van belang in kleine stukjes (1 mm²⁾en plaats het in 0,5 mL eiwitarme bindingsbuizen.
   2. Was met 100 μL 50% (v/v) acetonitril in 25 mM NH₄HCO₃, vortex 10-15 min, spin down, gooi de supernatant weg, herhaal 3x.
   3. Concentreer het monster met behulp van benchtop vacuüm concentrator gedurende 30 min om de gel stukken te drogen.
   4. Voeg 10 μL van 10 ng/μL sequencing grade trypsine toe en laat de gelstukken 5 minuten hydrateren.
   5. Voeg 25 mM NH₄HCO₃ net genoeg toe om de gelstukken te bedekken, verteerbaar bij 37 °C 's nachts.
   6. Breng de verteerde supernatant over in een schone siliconen buis van 0,65 mL. Voeg 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) mierenzuur (30 μL of genoeg om te dekken), vortex 10 min, spin en breng over in dezelfde extractiebuis. Herhaal 3x.
   7. Voeg 10 μL acetonitril toe aan de gelstukken, vortex 5 min en draai naar beneden. Breng de supernatant naar dezelfde buis.
   8. Concentreer de monsters met benchtop vacuüm concentrator op 2 μL, voeg 8 μL 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) mierenzuur toe aan het monster, vortex gedurende 15 minuten en spin neer bij 16.000 x g gedurende 30 min. Monsters zijn klaar voor massaspectrometrieanalyse.
   9. Ms-gegevensverwerving met LC-MS/MS uitvoeren met behulp van een vloeibaar chromatografiesysteem(Tabel van materialen)in combinatie met een massaspectrometrie-instrument(Tabel van materialen).
   10. Injecteer 8 μL gereconstitueerd monster op een kolom met vloeistofchromatografie (RPLC) in omgekeerde fase.
   11. Scheid de peptiden met een 2-80% gradiënt van oplosmiddel B in 60 min. Zorg ervoor dat het verloop bestaat uit een toenemend percentage oplosmiddel B van 2% tot 22% in 40 min, 22% tot 35% oplosmiddel B in 12 minuten, dan klimmen tot 80% oplosmiddel B in 4 min, en ten slotte bedrijf op 80% oplosmiddel B voor de laatste 4 min. Stel de stroomsnelheid constant op 300 nL/min.
       OPMERKING: Oplosmiddel A bevat 0,1% mierenzuur en 2% acetonitril, oplosmiddel B bevat 0,1% mierenzuur en 98% acetonitril. Alle concentraties worden weergegeven als volume/volume.
   12. Verzamel massaspectrometriegegevens met behulp van gegevensafhankelijke acquisitiemodus. Kortom, verzamel MS spectra in 350-1500 m/z voor 250 ms. Selecteer de Top 50 intense voorlopers met lading 2-5 voor verdere fragmentatie. Verzamel MS/MS spectra in 100-2000 m/z voor 100 ms, Sluit precursorionen uit herselectie voor 15 s.
   13. Open voor het zoeken in databases de commerciële software (zie Tabel van materialen)om massaspectrometriegegevens op het bureaublad te analyseren.
   14. Klik op de knop' LC' in het bovenste menu om een nieuwe zoekopdracht uit te voeren. Klik vervolgens op de knopToevoegenom de originele MS-onbewerkte gegevensbestanden te uploaden.
   15. Selecteer "Human Protein ID" in de "Paragon Methode" als de database zoekmethode. Doorzoek de originele MS raw data bestanden in de UniProt Homo Sapiens database (met 160.566 sequenties, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
   16. Stel zoekparameters als volgt in: selecteer trypsine als spijsverteringsenzym, laat maximaal 3 ontbrekende decolletés, 4 modificaties en 2-5 ladingen per peptide toe. Stel massafout in tot 20 ppm voor de eerste zoekopdracht en 0,02 Da voor gefragmenteerde ionen. Geef foutdetectiedrempels (FDR) op voor eiwit-, peptide- en modificatiesites van minder dan 1%. Stel alle andere parameters in de software in op standaardwaarden (zie figuur 3 voor massaspectrometrieanalyse).
   17. Klik op de knopOpslaan alsrechts van het bovenste menu, selecteer een map voor het opslaan van de zoekresultaten, voer de zoeknaam in en klik op de knopOpslaan.
   18. Klik op de knopProcesrechts van het bovenste menu om het zoeken te starten. Nadat de zoekopdracht is beëindigd, worden gegevens met de ingevoerde zoeknaam automatisch opgeslagen in de geselecteerde map. De gegevens kunnen eenvoudig worden geopend door Software F.
   19. Als u MS/MS-spectra van een specifiek peptide wilt verkrijgen, dubbelklikt u op de zoekresultaten om deze te openen door Software F. Klik eerst op het eiwit in de eiwitlijst bovenaan het menu en klik vervolgens op het peptide in het midden van het menu. De MS/MS van dit peptide staat onderaan het menu.
   20. Als u MS/MS-spectra wilt exporteren en opslaan, klikt u met de rechtermuisknop op de MS/MS-spectra onder in het menu, selecteert u kopiëren en plakken op een geschikt bestand zoals PPT- of doc-indeling.

Representative Results

EYFP-CENP-A K124 mutant toont alomtegenwoordigheid, interactie met HJURP, en geen gebreken in centromere lokalisatie noch cel letaliteit. Hier werd het door Fachinetti et al. (2017)⁶ gemelde systeem opnieuw gevormd: in diploïde menselijke (RPE-1) cellen die er een droegen verstoord en één ''floxed'' CENP-A allel (CENP-A^-/F), werd EYFP-CENP-A uitgedrukt uit de pBabe-EYFP retrovirusvector. In dit systeem kan de expressie van endogene CENP-A uit het CENP-A^-/F-allel worden verstoord door Cre recombinase⁶. Genconstructies van EYFP- CENP-A WT of K124R mutant (Figuur 1A), die het verlies van endogene CENP-A redt, werden stabiel uitgedrukt toen retrovirale integratie werd uitgevoerd. De resterende expressie van endogene CENP-A uit het CENP-A^-/F allel werd vervolgens verstoord door Cre recombinase. De expressie van endogene CENP-A werd niet gedetecteerd 7 dagen na de inductie van Cre recombinase (Figuur 1B, rijstroken 5-7). Zowel de expressie van EYFP-CENP-A WT als K124R-eiwitten bleek op een vergelijkbaar niveau te zijn als het oorspronkelijke endogene CENP-A-eiwitniveau(figuur 1B, rijstroken 3, 4, 6 en 7). Zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten toonden centromere lokalisatie op 7 dagen na de verstoring van de resterende expressie van endogene CENP-A uit het CENP-A^-/F allel (Figuur 1C-1E). Zowel EYFP-CENP-A WT als de K124R mutant toonden alomtegenwoordigheid en interactie met HJURP in tegenstelling tot het geval van met vlag getagde of niet-gelabelde CENP-A WT en de K124R mutant (Figuur 2A; gegevens die niet worden weergegeven voor CENP-A met vlagag tagged of untagged CENP-A)⁸. De levensvatbaarheid van de cel werd ook aangepakt door het uitvoeren van de kolonie uitgroei test 14 dagen na de verstoring van de resterende endogene CENP-A allel (Figuur 2B). Zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden een vergelijkbaar aantal ''gered'' kolonies 14 dagen na de verstoring van het resterende endogene CENP-A allel (figuur 2B en 2C). Dus, onze resultaten zijn in lijn met die gemeld door Fachinetti et al.⁶.

Ubiquitylation bij lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R werd onthuld door massaspectrometrie analyse. Er werd vastgesteld dat zowel EYFP-CENP-A WT als de K124R mutant alomtegenwoordigheid en interactie met HJURP vertoont in tegenstelling tot het geval van CENP-A WT met vlag label en de K124R mutant (Figuur 2A; gegevens die niet worden weergegeven voor CENP-A met vlag getagd of niet-gelabeld CENP-A)⁸. Deze resultaten suggereren dat de fusie van EYFP-eiwit alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant, en deze alomtegenwoordigheid op een andere site bevordert de interactie van EYFP-CENP-A K124R met HJURP. Alomtegenwoordigheid bij lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R werd onthuld in CENP-A^-/F cellen door IP-massa spectrometrie analyse (Figuur 3A en Figuur 3B). De lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R komt overeen met lysine 56 (K56) in CENP-A. Samen suggereren onze resultaten dat de fusie van groot-en klein eiwit (bijvoorbeeld EYFP-tagging) alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in CENP-A, en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt/maskeert het oorspronkelijke K124R enkel mutantenotype.

Figuur 1: EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliseert bij centromeres. (A) Representaties van de verschillende CENP-A eiwit constructies gelabeld met EYFP (verbeterde gele fluorescerende eiwit) op de N terminus. Rode letters markeren de positie van K124R aminozuur substitutie in de aangegeven constructie (links). De resultaten van de tests die in deze studie worden uitgevoerd worden getoond (rechts). (B) Uit de analyse van de westerse vlek bleek niet dat er detecteerbare endogene CENP-A aanwezig was. Immunoblots analyse om te controleren op de aanwezigheid van expressie van de aangegeven reddingsconstructies (ca. 45 kDa) voor en na Cre-infectie. De eiwitexpressie van pBabe-EYFP-constructen werd bevestigd vóór Cre-infectie (rijstroken 1-4), evenals na Cre-infectie (rijstroken 5-6). De afwezigheid van het endogene CENP-A-eiwit (ca. 15 kDa) werd bevestigd in de CENP-A^-/- cellijnen verzameld op 7 dagen na Cre-infectie (rijstroken 5-6). GAPDH eiwit werd gebruikt als een lading controle. (C) EYFP-CENP-A K124 mutant lokaliseert bij centromeres. CENP-A^-/F RPE-1 cellen werden gecotransfected met aangegeven constructies, gekweekt 7 dagen na retro-Cre virus infectie, en immunostained. Visualisatie van DAPI (blauw), EYFP (groen) en endogene CENP-B (rood), die diende als centromere locatiecontrole. Schaalbalk, 10 μm. (D) De lokalisatiepatronen in (C) samengevat als histogrammen. Per experiment werden meer dan 200 interfasecellen met EYFP-positieve signalen geteld (n ≥ 3 experimenten) en de gemiddelde percentages (±SD). ''Anderen (Non-centromere)'' toont meestal beschadigde cellen, dode cellen of cellen met nucleolar lokalisatie in interfase, die werden waargenomen als gevolg van transfectie of andere behandelingen. Geen significant (n.s.) verschil werd waargenomen in K124R in vergelijking met WT (Student's t-test). (E) Door HET EYFP afgeleide signalen bij centromeres in (C) werden gekwantificeerd. Signalen werden genormaliseerd naar die van WT, en de gemiddelde percentages (±SEM) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: EYFP-CENP-A K124 mutant is alomquitylated en interageert met HJURP, en de levensvatbaarheid van de cel werd niet beïnvloed door K124R mutatie van EYFP-CENP-A. (A) De EYFP-CENP-A K124 mutant is alomquitylated en interageert met HJURP. In vivo alomtegenwoordigheidstest. CENP-A^-/F RPE-1 cellen werden getransfecteerd met de aangegeven constructies. Eiwitten in 5% van de totale cellysaten (Input) en immunoprecipitaten (IP) met behulp van anti-GFP konijn polyklonale antilichaam werden gedetecteerd door westerse vlek analyse met behulp van de aangegeven antilichamen. Putatieve di-Ub-EYFP-CENP-A (**) en putatieve mono-Ub-EYFP-CENP-A (*) zijn aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Niikura et al.⁸. (B) Representatieve afbeeldingen van de uitgroeitest van de kolonie, zoals weergegeven in de regeling (boven) van twee verschillende voorwaarden ([1] en [2]) voor de aangegeven transfectanten van EYFP-CENP-A. (C) Histogrammen die het overleven van de kolonies van de experimenten in (B) samenvatten. De gemiddelde percentages (±SEM) van meer dan 3 onafhankelijke experimenten (n ≥ 3) worden genormaliseerd met het percentage overlevende kolonies in EYFP-CENP-A WT (EYFP-WT). p < 0,0001 en **p < 0,01 vergeleken met EYFP-besturingselement (Student's t-test). Geen significant (n.s.) verschil werd waargenomen in K124R in vergelijking met WT (Student's t-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Fragmenten van ubiquitylated EYFP-CENP-A K124R peptiden werden gedetecteerd door massaspectrometrie analyse. aA) Bewijs van alomtegenwoordigheid bij lysine 306 (K306) van EYFP-CENP-A K124R in RPE-1 CENP-A^-/F-cellen. De lysine 306 (K306) van EYFP-CENP-A K124R komt overeen met lysine 56 (K56) in CENP-A. Het LQK^LRGGSTHLLIR peptide (dekking 95,9%, vertrouwen 87,8%) geïdentificeerd door botsing-geïnduceerde dissociatieanalyse wordt weergegeven. De m/z (Da) waarden van de b (groene) en y (rode) ionen in de spectra van (A) die tijdens fragmentatie zijn gedetecteerd, worden gemarkeerd met groen in de tabel van (B). De alomtegenwoordigheid van K306 wordt bevestigd door het LRGG-motief (onvolledig decolleté) van de b-3 ion (m/z 753.4730) en y-8 ion (m/z 1350.8328). (B) De tabel belicht de m/z (Da) waarden van de b (groene) en y (rode) ionen in de spectra van (A). LQK^[Umc]STHLLIR in de tabel van (B) geeft het LQK^LRGGSTHLLIR peptide aan in (A). Deze cijfers zijn gewijzigd van Niikura et al.⁸. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

B-nummer	Relevant kenmerk(en)	Verwijzing	Bron
B3027	pBabe-puro-Cre	Niikura et al., 2019	Dr. Amruta Ashtekar, Dr. Lawrence S. Kirschner
B3182	pBabe-EYFP	Niikura et al., 2019	-
B3161	pBabe-EYFP-CENP-A WT	Niikura et al., 2019	Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3164	pBabe-EYFP-CENP-A K124R	Niikura et al., 2019	Dr. Daniele Fachinetti, Dr. Don W. Cleveland
B3031	psPAX2 psPAX2	Niikura et al., 2019	Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
D3032	pMD2.g	Niikura et al., 2019	Dr. John Thompson, Dr. Gustavo W. Leone
B3189	Pgp	Niikura et al., 2019	Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan)
B3190	pCI-VSVG	Niikura et al., 2019	Dr. Kenji Tago (Jichi Medical Univeristy, Japan)
B3001	pPAM	Niikura et al., 2019	-
B3252	pQCXIP-EYFP	Niikura et al., 2019	-
B3254	pQCXIP-EYFP-CENP-A WT	Niikura et al., 2019	-
B3256	pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R	Niikura et al., 2019	-
B2806	pCGN-HA-Ubiquitin	Niikura et al., 2019	-

Tabel 1: Plasmidvectoren die in deze studie worden gebruikt.

B-nummer	Helper/verpakking plasmidevectoren	Combinatie 1	Combinatie 2	Combinatie 3
B3031	psPAX2 (lentivirale gag/pol vector)	2μg
D3032	pMD2.g (lentivirale env vector)	2μg
B3189	pGP (retrovirale gag/pol vector)		2μg
B3190	pCI-VSVG (retrovirale env vector)		2μg
B3001	pPAM (amphotropic helper vector codering retrovirale gag-pol-env)			2μg

Tabel 2: Combinaties van hulp-/verpakkingsplasmidevectoren die worden gebruikt in (1.1.3): Retrovirustransfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructen.

Aanvullende coderingsbestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.

Discussion

Hier beschreven we methoden van massaspectrometrie analyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren suggereert dat de EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit⁸. In onze resultaten hebben we met succes alomtegenwoordigheid geïdentificeerd op lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, die overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrieanalyse. De hier beschreven massaspectrometrieanalyse is een nabootsingsmethode zoals we eerder de lysine 124 (K124) alomtegenwoordigheidssite van CENP-A WT-Flag¹²identificeren. Daarom kan deze methode worden toegepast op menselijk CENP-A-eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore-eiwitten. De massaspectrometrieanalyse op basis van LC-MS/MS wordt algemeen aanvaard om potentiële posttranslationele modificaties (PTMs) van een breed spectrum van eiwitten te identificeren. Onze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests/analyses (d.w.z. in vivo alomtegenwoordigheidstest, kolonieuitgroeitest en massaspectrometrieanalyse) kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid(s) van hun doeleiwit(s).

Dit protocol heeft echter geen betrekking op de detectie van alomquitylated banden en/of identificatie van locatiespecifieke alomtegenwoordigheid(en) van deze eiwitten in levende cellen of een specifieke eencellige cel gedurende de hele celcyclus. Deze jaren worden optogenetische benaderingen dramatisch ontwikkeld en geven een hoge impact op kwantitatieve studies van celsignaleringssystemen. Optogenetica heeft oorspronkelijk benaderingen die precies activeren of remmen individuele neuronen met behulp van single-component, microbiële opsin-gebaseerde systemen. Momenteel kan eiwitactiviteit met ongekende spatiotemporale precisie worden gecontroleerd door gebruik te maken van natuurlijke genetisch gecodeerde fotoreceptoren, en verschillende genetisch gecodeerde instrumenten maken lichtbeheersing van vele biologische processen mogelijk, waaronder eiwitfossylatie^15. Daarom is optogenetica een veelbelovend systeem om spatiotemporale eiwitkinasesign signalering te onderzoeken op de cellulaire en het gehele organismeniveau. Het aantal lichtgecontroleerde eiwitkinases neemt snel toe, hoewel het huidige aantal nog steeds beperkt is. Echter, de ontwikkeling van licht-gecontroleerde eiwit alomtegenwoordigheid wordt vertraagd, en hoog moleculair gewicht tagging van fotoreceptoren kan verstoren de alomtegenwoordigheid van zowel WT en mutant eiwitten en functioneel veranderen de inheemse eiwitfunctie als bebost. Daarom is de ontwikkeling van lager moleculair gewicht tagging of indringende techniek is dringend nodig om alomtegenwoordigheid te visualiseren en / of om spatiotemporale eiwit alomtegenwoordigheid signalering te onderzoeken op de levende cellulaire en het gehele organisme niveaus.

In deze studie is EYFP vectorcontrole essentieel voor controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken. Niet-specifieke interactie met EYFP-eiwit wordt vaak waargenomen in het immunoprecipitatie-experiment, waardoor EYFP-vectorcontrole onmisbaar is om de ware interactie van met EYFP-gesmolten eiwit(en) te evalueren. Onze massaspectrometrieanalyse met behulp van EYFP-CENP-A K124R uitgedrukt in de RPE-1 CENP-A^-/F-cellen toonde geen alomtegenwoordigheid op lysinesites in de EYFP-polypeptide-sequentie. In andere onbekende omstandigheden kan echter worden verwacht dat de lysinesite in de EYFP-polypeptide-sequentie is opgenomen in EYFP- en/of ander gelabeld fusie-eiwit met een hoog moleculair gewicht.

Voor kolonie uitgroei testen, is het raadzaam om cellen te verzamelen voor westerse vlek analyse om eiwituitputting van endogene CENP-A te bevestigen na retro-Cre virusinfectie en eiwitexpressie van pBabe-EYFP-CENP-A constructen. Op deze manier kunnen we beoordelen of de kolonie ontgroeid fenotype is echt te wijten aan de enige expressie van exogene CENP-A WT of mutanten. Voor elke westerse vlek analyse, als strippen wordt uitgevoerd om het membraan reblot met verschillende antilichamen voor de volgende draai van de westerse vlek analyse, moet men gebruik maken van dezelfde kwantitatieve detectie systeem als een vorige beurt vlek voor de volgende beurt vlek met verschillende antilichamen. Men moet ervoor zorgen dat de banden in de vlek van de vorige beurt niet detecteerbaar zijn op het beoogde gebied van het membraan in de vlek van de volgende bocht met verschillende antilichamen. Of gebruik hetzelfde kwantitatieve detectiesysteem als de vlek van de vorige beurt en controleer of de incubatie met het loutere secundaire antilichaam dat in de vlek van de vorige beurt wordt gebruikt, niet leidt tot de detectie van eiwitbanden voordat de volgende beurt met verschillende antilichamen begint. Voor in vivo alomtegenwoordigheidstest is het belangrijk om grotere SDS-PAGE gel te draaien met behulp van het apparaat om grotere SDS-PAGE gel (Gel elektroforese apparaat I of II) te draaien. Empirisch, grotere SDS-PAGE gel zou eiwitbanden duidelijk scheiden en de gevoeligheid verbeteren van de detectie van de zwakke banden die slecht kunnen zijn gedetecteerd in de kleinere gel (dat wil zeggen, eiwitbanden lijken scherper in grotere gel).

Het is uiterst belangrijk om de juiste SDS-PAGE gel te kiezen om post-translationele wijzigingen (PTMs) van een specifiek eiwit grondige LC-MS/MS in kaart te brengen. Het meest gebruikte gelsysteem voor SDS-PAGE is het Laemmli-systeem, dat tris-glycinegels gebruikt, bestaande uit een stapelengelcomponent en de oplossende gelcomponent. In dit klassieke systeem verschillen de pH- en ionische sterkte van de buffers die worden gebruikt in de stapelgel (Tris, pH 6.8) en het oplossen van gel (Tris, pH 8.8) van de buffer die wordt gebruikt voor het uitvoeren van de gel (Tris, pH 8.3). Bandvervorming, verlies van resolutie of artefactbanden kunnen worden veroorzaakt door de zeer alkalische operationele pH van het Laemmli-systeem. In het vorige verslag worden belangrijke oorzaken van slechte bandresolutie met het Laemmli-systeem¹⁶beschreven, met inbegrip van instabiliteit en korte afloopperiode van de oplossende gel als gevolg van hydrolyse van polyacrylamide bij de hoge pH; chemische veranderingen van monstereiwitten, reoxidatie van verminderde disulfides van cysteïneresiduen van eiwitten en decolleté van Asp-Pro-bindingen van eiwitten met verwarming bij 95-100 °C in de laemmli-monsterbuffer bij pH 5.2. De commercieel verkrijgbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels zijn Bis-Tris HCI-gebufferd (pH 6.4) en werken op pH ca. 7.0 in tegenstelling tot traditionele Tris-glycine gels¹⁶. De talrijke verdiensten in vergelijking met het Laemmli-systeem worden gegenereerd door de neutrale operationele pH van de Bis-Tris-systemen¹⁶, met inbegrip van hoge stabiliteit en lange houdbaarheid van de oplossende gel, verbeterde monstereiwitstabiliteit tijdens elektroforese bij neutrale pH die leidt tot scherpere bandresolutie en nauwkeurige resultaten, en volledige vermindering van disulfides en afwezigheid van decolleté van Asp-Pro-bindingen. In dit rapport konden we met succes PTMs van EYFP-CENP-A K124R eiwit(figuur 3) in kaart brengen met behulp van de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels. Daarom worden de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels ten zeerste aanbevolen om voor dit doel te gebruiken.

Voor het in kaart brengen van post-translationele wijzigingen (PTMs) van een specifiek eiwit wordt in-gel vertering van doeleiwit in combinatie met LC-MS/MS op grote schaal gebruikt. In deze studie hebben we getracht alomtegenwoordigheidssites EYFP-CENP-A K124R te identificeren met behulp van de affinity purification-mass spectrometrie (AP-MS) strategie. Daarom is de eerste stap is het verkrijgen van een grote hoeveelheid ubiquiineerde EYFP-CENP-A K124R eiwit met een hoge zuiverheid met behulp van immunoprecipitatie van EYFP-CENP-A K124R overexpressie cellen, die sterk zou kunnen vergemakkelijken de identificatie en bevestiging van alomtegenwoordige sites van EYFP-CENP-A K124R door LC-MS/ MS. Om de interferentie van niet-alomtegenwoordig EYFP-CENP-A K124R-eiwit te verminderen, westelijke vlekken van anti-GFP, anti-HA (Ub), anti-Ubiquitin (zie sectie [6.1.6]), en Coomassie blauwe vlekken (zie sectie [6.1.7]) werden uitgevoerd om de positie van ubiquidinated EYFP-CENP-A K124R op SDS-PAGE gel nauwkeurig te bepalen. Ten slotte werd slechts een geminimaliseerd gebied van gelband met ubiquidale EYFP-CENP-A K124R uitgesneden voor in-gel spijsvertering in combinatie met LC-MS/MS om geoptimaliseerde resultaten te krijgen. Wanneer de gedroogde peptiden opnieuw worden samengesteld voordat LC-MS/MS wordt gebruikt, werd 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) mierenzuur gebruikt om de oplosbaarheid en het herstelpercentage van peptiden te verbeteren. Soms is de database zoeken kan resulteren in PTMs die niet echt bestaat als gevolg van de geschatte toewijzing algoritme van zoekmachine. Een andere kritieke stap is dus om EYFP-CENP-A K124R-alomtegenwoordigheidssites te bevestigen via het handmatig beoordelen van MS/MS van alomtegenwoordige peptiden met behulp van Software F(Table of Materials),die "onwerkelijke" alomtegenwoordatiesites die door geschatte toewijzing door databasezoeken zijn geïntroduceerd, kunnen elimineren. Samengevat heeft deze AP-MS-strategie een efficiënte en robuuste pijplijn opgezet voor de identificatie van EYFP-CENP-A K124R-alomtegenwoordigingslocaties met een cruciale biologische betekenis. Wat nog belangrijker is, deze pijpleiding kan ook op grote schaal worden uitgebreid om de PTMs van verschillende functionele eiwitten te onderzoeken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubes	Eppendorf	022431064	For mass spectrometry analysis
10cm cell culture dish	BIOFIL/JET, China	700224	10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture Cluster	Fisher/Corning Incorporated	07-200-83	6-well culture plate
CentriVap	LABCONCO	-	Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm	Eksigent Technologies	805-00120	Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis
HCX PL APO 100x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE	100X Oil immersion lens
HCX PL APO 63x oil immersion lens	Leica	LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS	63X Oil immersion lens
Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	For western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope	Leica	-	motorized fluorescence microscope
Leica EL6000 compact light source	Leica		External light source for fluorescent excitation
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)	Surgipath	105	Cover glass (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus	Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences	31071010	Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel
nanoLC.2D	Eksigent Technologies	-	liquid chromatography system for mass spectrometry analysis
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher	NP0335BOX	The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	-	Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD camera	Hamamatsu	C10600-10B	CCD camera
PAP Pen	Binding Site	AD100.1	For a water repellant barrier in immunofluorescent staining
TISSUE CULTURE DISHES 10CM	VWR	25382-166	10 cm tissue culture dish
Vertical electrophoresis for gel running (big size)	Junyi, China	JY-SCZ6+	Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, Frosted	VWR International	48312-013	Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibody	Stressgen/Enzo Life Sciences	KAM-CC006	Mouse monoclonal antibody
Anti-CENP-B antibody	Novus Biologicals	H00001059-B01P	Mouse monoclonal antibody
anti-GAPDH	ABCAM	ab37168	Rabbit polyclonal antibody
anti-GAPDH	Invitrogen	PA1987	Rabbit polyclonal antibody
anti-GFP antibody	ANTI #76 (Homemade antibody)		Rabbit polyclonal antibody
anti-HA (3F10)	Roche	11815016001	Rat monoclonal antibody
anti-HJURP	Proteintech Group	15283–1-AP	Rabbit polyclonal antibody
anti-Ubiquitin	Bethyl Laboratories	A300-317A-1	Rabbit polyclonal antibody
Reagents
Bio-Rad Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)
Branson SONIFIER 450			Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33995-325	Disruptor horn for sonication
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm	VWR Scientific Products Inc.	33996-185	Microtip for sonication
Buffer A1	-	-	20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11-873-580-001	Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250	BBI Life Sciences	CAS 6104-59-2	Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis
Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)	SigmaI-Aldrich	HT90132-1L	For colony staining
DAPI	SIGMA-SLDRICH	D9542	For nuclear staining
DMEM: F12 Medium	ATCC	30-2006	DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Life Technologies/Gibco	10082	FBS (fetal bovine serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Life Technologies/BioWhittaker	12-604	high-glucose DMEM
Lipofectamin 3000	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solution	Life Technologies/Invitrogen	L3000	Transfection reagent II for chemical transfection
Methanol	Fisher	A412-4	Fixation reagant
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)	Fisher Scientific	NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)	Non-fat skim milk
Opti-MEM I	Life Technologies/Invitrogen	31985	Reduced serum media
p-phenylenediamine	SIGMA-SLDRICH	P6001	For mounting medium
Penicillin, Streptomycin; Liquid	Fisher/Gibco	15-140	Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTION	SIGMA-SLDRICH	P 8920	Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water
Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml	Polysciences	23966–2	Transfection reagent III for chemical transfection
Protein A sepharose CL-4B beads	GE Healthcare/Amersham	17-0963-03	Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	PI21059	Western Blot Stripping Buffer I
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	For mass spectrometry analysis
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo	34095	Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate
UltraPure Distilled Water	Life Technologies/Invitrogen/Gibco	10977	Sterile tissue culture grade water
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)	-	-	Western Blot Stripping Buffer II
Secondary antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11008	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG	Life Technologies/Invitrogen	A11005	fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW software	Olympus	-	Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT software	Olympus	-	Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18	Olympus	-	Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0	LI-COR Biosciences	-	Software D
Molecular Imager Versadoc MP4000 System	Bio-Rad	-	Chemiluminescence imager for immunoblot detection
Odyssey CLx Infrared imaging System	LI-COR Biosciences	-	Infrared imaging system for immunoblot detection
OpenCFU saftware	-	-	For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software	Improvision/PerkinElmer	-	Software A
ProteinPilot Software version 4.5	AB SCIEX	-	Software F for mass spectrometry analysis
Quantity One 1-D analysis software	Bio-Rad	-	Software E
TripleTOF 5600+ System	AB SCIEX	-	Mass spectrometry instrument
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)	PerkinElmer	-	Software B1
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)	PerkinElmer	-	Software B2