Cancer Research
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斑马鱼中具有功能化荧光硅纳米粒子的异种移植人类癌细胞的Vivo靶向
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Summary May 8th, 2020
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这里描述的方法是利用斑马鱼胚胎研究功能化纳米粒子在体内瞄准人类癌细胞的能力。此方法允许评估和选择最佳纳米粒子，供将来在大型动物和临床试验中进行测试。
Transcript
该程序允许研究人员评估和选择最佳纳米粒子，用于大型动物的研究和临床试验。这个简单的方法有助于确定纳米粒子是否可以瞄准体内的人类癌细胞，如果是，目标效率如何。演示这些程序的将是博士后秦秀丹博士和来自我们实验室的研究技术人员安德鲁·林先生。
晚上用鱼水填充两个腔室交配罐，并使用分压器将上部水箱分开。将雄性斑马鱼放入腔室的一侧，将一条或两只雌性斑马鱼放入腔室的另一侧。第二天早上 8：00 拆下分隔线。
添加人工富集植物，稍微倾斜顶室，形成浅水区。允许斑马鱼繁殖三到四个小时，并通过网状水从底部腔室收集鸡蛋。将鸡蛋转移到每盘不超过200个鸡蛋的培养皿中。
取出任何死鸡蛋或未受精卵。将菜装满三分之二的新鲜鱼水，并放在孵化器中。24小时后，从培养箱中取出盘子，并尽可能多地从培养皿中取出水。
加入几滴每毫升一毫克的蛋白酶溶液，轻轻旋转的菜。当胆小子出现解体迹象时，移液器上和向下移液几次，以分解胆小子并释放胚胎。一旦大部分胚胎都出卵，立即加入新鲜的鱼水以终止这个过程。
用鱼水冲洗胚胎三次，取出漂浮的胆小子将胚胎返回孵化器。在100毫升的自动处理鱼水中加入3克电泳级加糖，使3%的加糖溶液得到处理。微波加糖和水，直到加糖完全溶解。
要创建注射板，将热的阿加罗斯溶液倒入培养皿中，直到其满四分之三，然后将微注塑模具放在加糖上。凝固后，小心地去除模具。用自动捕获的鱼水填充产生的注射板，并将其储存在四摄氏度。
要制作注射针，在移液器拉拔器上拉一毫米外径 0.78 毫米的硅酸盐玻璃毛细管。将注射针放在用乙醇毛巾擦拭的大培养皿中。在收获 HeLa 细胞之前，在 35.5 摄氏度的培养箱中重新加热注射板和鱼水。
移植前30分钟至1小时，收获希拉细胞。在组织培养罩中工作，通过吸气从烧瓶中去除介质。用无菌 PBS 冲洗细胞，以去除介质的所有痕迹。
在烧瓶中加入三毫升无菌尝试性尝试性EDTA，并在37摄氏度下孵育3至5分钟。观察显微镜下的烧瓶，监测酶消化的进度。当大约80%的细胞被悬浮时，在烧瓶中加入6到8毫升的生长介质。
通过轻轻移液收集细胞，并转移到15毫升无菌管。将管子在135倍G下离心5分钟。吸升液，在三毫升完全生长的介质中重新暂停 HeLa 细胞。
重复洗涤步骤两次后，将细胞重新在一毫升的完整生长介质中重新暂停。然后使用血细胞计在显微镜下计算细胞。再次离心细胞后，取出上经剂。
将细胞以每毫升1.5毫升的微离心管中的浓度为10倍的5倍至第七细胞。在运送到鱼设施时，用一只手握住管子，使细胞保持温暖。使用塑料移液器，将斑马鱼胚胎放在注射板上。
将胚胎放在两侧，前朝向前与板上的凹槽对齐。打开空气源和微型喷油器。从培养箱中检索到 HeLa 细胞后，使用 P200 将细胞上下移液 20 到 30 次。
使用带切口的凝胶加载尖端，立即将三个微升的 HeLa 细胞悬浮液加载到其中一个注射针中。将针头插入针架，并将注射板放在显微镜下。通过踩脚踏板将细胞混合物注射到腹腔下血管化区域的胚胎中。
然后移液几滴无菌鱼水到胚胎上。要继续注射过程，请使用非显性手将注射板移动到下一个胚胎，然后使用显性手在同时踩脚踏板的同时伸展和缩回喷油器。完成盘中所有胚胎的注射，用无菌鱼水将胚胎洗入无菌培养皿中。
立即在35.5摄氏度下孵育这道菜。三个小时后，检查注射的胚胎并取出死去的胚胎。第二天，为纳米颗粒做注射针，并将其储存在一个大的培养皿中的推杆上。
在荧光显微镜下工作，小心地拾取有尾部转移的胚胎，并把它们放在新的注射板上，用无菌鱼水。对于每条有尾部转移的斑马鱼，在眼睛后面注射纳米颗粒溶液或水。还要在未接受 HeLa 移植的对照组斑马鱼的眼睛后面注射纳米颗粒溶液，并在 35.5 摄氏度下孵育所有注射的胚胎。
注射后，每隔30至60分钟，将两到三个胚胎移植到培养皿中，加入五滴稀释的MS222溶液，使胚胎固定。一旦胚胎停止游泳，取出大部分水，让胚胎躺在它们的两侧。使用一个移液器与薄软刷连接到它的末端，对齐胚胎，使它们躺在前朝前，只有一只眼睛可见。
使用 2 倍放大倍率，在红色、蓝色和亮场通道上捕获整个胚胎的图像。要捕获尾部区域，请以 6.4 倍的放大倍率对胚胎进行成像。将胚胎聚焦在红色通道下，以避免纳米粒子出血。
成像后，立即将新鲜的鱼水加入胚胎，并将它们返回到孵化器。使用荧光显微镜对斑马鱼胚胎进行注射和控制。红点是转移性人类宫颈癌细胞，而蓝点代表纳米粒子。
在一个对照组中，被注射了癌细胞但非纳米粒子的斑马鱼，在红色通道中可见荧光 HeLa 细胞，在蓝色通道中未检测到特定的荧光信号。在其他对照组中，斑马鱼被注射了纳米粒子，但没有与癌细胞注射。蓝色荧光纳米粒子分布在整个循环系统中。
没有明显的红色荧光。当有尾部转移的斑马鱼被注入纳米粒子时，红蓝通道的叠加图像显示了 HeLa 细胞和纳米粒子的共同定位。该方法执行后，可以分析肿瘤负担和癌细胞存活率，对有无注射纳米粒子的动物进行检测，调整其杀癌细胞的能力。
该技术可能有助于选择最佳纳米粒子，可以专门识别体内癌细胞，从而早期发现癌症和癌症转移。
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