チラリア性神経節ニューロンの分離と培養

鶏毛様体神経節とは、眼の後部に局在する構造であり、脈絡膜裂動部の視神経に隣接する。毛様性神経節ニューロンは、副交感神経系に属し、コリン作動性ニューロンであり、したがって、コリン作動性シナプスを確立することができる。毛様体系神経節は毛様体ニューロンと脈絡膜神経細胞の巨大な集団で構成され、構造的にも機能的にも異なる。

したがって、毛様体ニューロンは眼内筋を内輪にし、脈絡膜ニューロンは眼の気分筋を内側に入れさせる。そして、培養の最初の日、毛様神経節ニューロンは多極形態を提示し、その後、神経突起の1つが伸びて軸索を形成する単極状態に移行し始める。毛様神経節ニューロンを用いた最も一般的な研究の1つは、コリン作動性シナプスである神経筋シナプスの研究であり、毛様神経節ニューロンの使用は、得られたニューロン集団がコリンライナーであるという意味で、以前のモデルと比較して良い代替手段となっている。私たちが神経集団で働いているときには起こりませんが、それは完全にコリン作動性ではありません。

毛様体の同定と解剖は、初めてそれを行う人にとって非常に困難な場合があるので、ここでは毛様体の神経節の適切な同定と解剖、ならびにこれらのニューロンの成功した培養のためのガイドラインのために、ステップごとのプロトコルを提供します。カバーリップの調製には、13ミリメートルのガラスカバーリップ、耐酸性容器、65%硝酸、ピンセット、ミリQ水、75%エタノール、軌道シェーカーが必要です。主要な文化のためのカバーリップの準備は、手順の2日前に行われるべきである。

必要な数のガラスカバーリップを酸耐性容器の中に入れ、65%硝酸を加え、すべてのカバーリップが覆われるまで添加します。容器を軌道シェーカーに入れ、攪拌で室温で一晩インキュベートする。翌日、慎重に硝酸を除去し、再利用するための星。

カバーリップを洗い、容器にミリQ水を加えます。もう一度、30分間撹拌を行い、洗浄液を捨て、この処理を5回繰り返す。75%エタノールを使用してカバーリップを2回リンスします。

慎重に分離し、アルミニウム箔で覆われた金属ラックに個々のカバーリップを配置し、50度でインキュベートし、10〜15分間、または完全に乾燥するまで。UV光でカバーリップを10〜15分間殺菌します。カバーリップをコーティングするには、滅菌ガラスカバーリップ、24ウェルプレート、滅菌ピンセット、0.1ミリグラム/ミリリットルPDL溶液、滅菌水、ミリリットルラミニン溶液あたり10マイクログラム、プレーン神経基底培地、毛様体神経節完全培地が必要です。

カバーリップのコーティングは、手順の前日に行われるべきです。滅菌用のツイーザーを使用して、24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを1つ置き、500マイクロリットルのポリ透析溶液を1ミリリットル当たり0.1ミリグラムの濃度で加え、37度で一晩インキュベートします。翌日、カバーリップを滅菌水で3回洗い、水を捨て、各井戸に1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で350マイクロリットルのラミニン溶液を加えます。

インキュベーターに37度で2時間置きます。この時間の後、細胞めっきの前に、ラミニン溶液を取り除き、300マイクロリットルのプレーンニューロ基底培地で2回洗浄する。完全な培地の300マイクロリットルを追加し、インキュベーターに37度と5%CO2で、細胞をプレートする準備ができるまで入れられます。

解剖手順では、胚性7日目の鶏卵、75%エタノール、解剖鉗子数545と番号55、はさみ、スプーン、黒底と氷冷HBSS溶液を備えたペトリ皿を解剖する必要があります。75%エタノールですべての解剖ツールを殺菌することを確認してください。卵は卵インキュベーターで、37.7度、7日間、または他の望ましい胚期にインキュベートされる前に16度で保存する必要があります。

処置の日に、インキュベーターから卵を取り出し、75%エタノールで卵をスプレーする。はさみを使って卵の上を手に入れ、スプーンを使って慎重にエンブロイを取り出します。胚を、氷冷HBSS溶液付きのシャーレに入れ、頸部領域で切断することによって頭部を体からすぐに分離する。

その後、きれいな氷冷HBSS溶液で新しいシャーレに頭を移します。胚が卵から取り出されるとすぐに、細胞死の原因となるプロテアーゼを産生することができる。したがって、胚が卵の外に出て細胞死を最小限に抑えたら、できるだけ早く頭部を身体から分離することが重要です。

また、胚の頭部を氷冷HBSS溶液に保つことも非常に重要です。胚の頭を上げて、ひよこのくちばしに固定し、目の周りの皮膚の薄い層を取り除き始めます。頭から離してそっと回転して目を取り除きます。

そして、ひよこの頭から目を分離しながら、視神経が切り離されていることに気づく。後部側を上にして目を離し、センサー視神経と脈絡膜裂けに隣接する毛様体神経節に注目してください。前神経節神経はまだ毛様様神経節に付着し、その同定を容易にする。

各目から毛様様神経節を解剖し、過剰な組織を除去して非常によくきれいにする。解剖した神経節を氷の上にHBSS溶液を入れたシャーレに移します。1ミリリットル当たり約100万個の細胞の収量を有するためには、約70個の神経節を解剖し、また、得られた細胞集団は、非神経細胞も有するので、非神経細胞の数を減らすために、また、あなたの神経細胞の純度を増加させるために、毛様神経節をきれいにすることが重要であることを覚えておいてください、すべての過剰な組織を除去する。

組織解離には、24ウェルプレート、0.1%トリップイン溶液、不完全な毛様体神経節培地、火で研磨ガラスパスツールピペット、プラスチック製のパスツールピペットが必要です。無菌プラスチック製のパスツールピペットを事前に濡らし、すべての毛様体神経節を15MLチューブに収集し、遠心分離機を200 Gsで2分間回収し、パスツールピペットを使用してすべてのHBSS培地を取り除き、ペレットに近づいたらマイクロピペットを使用します。溶液に0.1%のトリップインの1ミリリットルを加え、水浴で37度で20分間インキュベートします。

2分間の遠心分離機、200 Gs.直ちに、トリップイン溶液を取り除き、不完全な培地を1ミリリットル加える。血清は不完全な培地中で、すぐにトリプシンの活性を停止する。200Gsで2分間遠心分離機を、すべての培地を取り除きます。

500マイクロリットルの完全培地を加え、P1000マイクロピペットを用いて組織解離を開始する。10~15回ピペットを上下にピペット化して開始し、火で磨かれたガラスのパスツールピペットピペットに切り替え、再びピペットを10~15回上下に切り替えます。細胞懸濁液は、組織解離に成功した兆候として、ぼやける必要があります。

細胞の解酸塩に必要な体積は、この中で得られる毛様核様の数とペレットサイズに依存する。組織を解像するために上下にピペットを作るとき、気泡の形成を避けることは重要であり、これは細胞損失を最小限に抑える。細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液をめっきするまで氷の上に残すことができます。

ニューバウアーチャンバーでトリパンブルー溶液を使用して細胞密度を決定します。そのリードセル懸濁液を完全培地で、5FTUで、所望の密度で、ウェル当たり500マイクロリットルの細胞をプレートする。37度と5%CO2で細胞をインキュベートします。

私たちの培養を毎日確認し、細胞の発達に従ってください。毛様神経節細胞はインビトロで非常に速く発達し、1日後にすでに細胞体からいくつかの神経突起が広がっているのを見ることができます。インビトロで7〜8日後、神経細胞ネットワークは非常によく確立され、細胞は少なくとも15日間維持することができる。

1日のインビトロの後、毛様体神経節ニューロンは多極神話を示す。しかし、神経突起拡張は、ニューロンにおいて急速に起こり、神経回路網は24時間後に既に確立されている。インビトロでは、毛様体神経節ニューロンは、眼の筋肉の活性化を担当する。

そして、これらの神経細胞培養は、神経筋シナプスの研究に非常に適している。このために,毛様体神経節ニューロンは筋肉細胞の上にめっきすることができる。ここでは、目V7ひよこ胸筋ニューロンの上に、目の胸膜、CGニューロンの成功した培養を示す。

シナプス小胞マーカーSV2は、CGニューロン軸索と筋線維との間に確立された活性シナプスを示し、複数の核によって容易に同定される。このプロトコルで得られた毛様神経節ニューロンは、免疫細胞化学、電気生理学、および生存エッセイなどに適しています。この解剖プロトコルは、非常に少ない数のニューロンを生み出すが、適切に行われれば、コリン作動性ニューロンの純粋な集団を提供する。

各神経節が非常によく洗浄され、過剰な組織が除去されるのは非常に重要です。そのためには、高品質の器具を使用する必要がありますので、この組織は、非神経細胞による汚染を防ぐために除去することができます。胚の年齢は、私たちのプロトコルの成功を決定します。

理想的には、解剖はE7とE8の間で行われるべきである。この段階では、通常インビトロで発生する発達細胞死はまだ起こっていないので、この時点は非常に重要です。これらの非神経細胞の汚染を最小限に抑えるために、5FTUを培養培地に用い、グリア細胞や線維芽細胞の増殖を最小限に抑えています。この細胞モデルは、あなたのヌエロムクスラー病を研究するための優れた代替手段を提供します。

このプロトコルに基づいて、特定の炭酸塩および特定のタンパク質のサブ細胞局在化がシナプスの形成と機能をどのように調節するかを、追加の科学的な質問に対処することができる。さらに, 神経筋疾患の研究のようなさらなる質問に対処するために神経筋の共同培養を確立するかなり簡単です。.