Isolering och kultur chick Ciliary Ganglion nervceller

Kycklingen ciliary ganglion, är en struktur lokaliserad i den bakre delen av ögat, intill synnerven i koroiden spricka. Och de ciliary ganglion nervceller, tillhör det parasympatiska nervsystemet, och är kolinerga nervceller, och därmed kan de upprätta kolinerga synapser. Ciliary ganglion består av en enorm population av ciliary nervceller och koroidal nervceller, som är strukturellt och funktionellt distinkta.

Så ciliary nervceller innervates intraokulära muskler, och koroidal nervceller innervates humör muskel i ögat. Och för de första dagarna i kulturen, den ciliära ganglion nervceller presentera en multipolär morfologi, och efter dessa, de börjar övergången till en unipolär stat, där en av neuriterna sträcker sig och bildar axon. En av de vanligaste studierna med ciliary ganglion nervceller, är en studie av neuromuskulära synapser, som är kolinerga synapser, och användningen av ciliär ganglion nervceller har blivit ett bra alternativ, jämfört med tidigare modeller, på grund av det faktum att den neuronala befolkningen erhålls, är homogen i den meningen att, alla de nervceller är kolinerga, och därmed de kan upprätta funktionella synapser med de muskelceller , vilket inte händer när vi arbetar med en neuronal population, som inte är helt kolinerga.

Identifieringen och dissekering av ciliära ganglion kan vara ganska utmanande för någon gör det för första gången, så här ger vi ett steg för steg protokoll, för lämplig identifiering och dissekering av ciliary ganglion, liksom riktlinjerna för framgångsrik kultur av dessa nervceller. För framställning av täcken behöver du, 13 millimeter glasöverdrag, en syraresistent behållare, 65%salpetersyra, pincett, Milli-Q vatten, 75%etanol och en orbital shaker. Beredningen av de coverslips för primära kulturer, bör göras två dagar före förfarandet.

Placera önskat antal glasöverdrag, inuti en syraresistent behållare, och tillsätt 65%salpetersyra, tills alla täcks. Placera behållaren i en orbital shaker, och inkubera över natten vid rumstemperatur med agitation. Nästa dag, försiktigt ta bort salpetersyra, och stjärna för återanvändning.

Tvätta täcken, tillsätt Milli-Q vatten till behållaren. Återigen, placera agitation i 30 minuter, kasta tvättlösningen, och upprepa denna process fem gånger. Skölj täckskydden två gånger med hjälp av 75%etanol.

Separera försiktigt och placera enskilda täckslipar i ett metallställ, täckt med aluminiumfolie, och inkubera i 50 grader, i 10 till 15 minuter, eller tills de är helt torra. Sterilisera täcken i UV-ljuset, i 10 till 15 minuter. För beläggning av täcken, behöver du, sterila glas täcken, en 24-Well platta, steril pincett, 0,1 milligram per milliliter PDL lösning, sterilt vatten, en 10 mikrogram per milliliter laminin lösning, vanligt neurobasalt medium, och ciliär ganglion komplett medium.

Beläggningen av täcken, bör göras dagen före proceduren. Med hjälp av en steril pincett, placera en täckskydd i varje brunn av en 24-Well platta, tillsätt 500 mikroliter poly dialysning lösning, vid en koncentration av 0,1 milligram per milliliter, och inkubera över natten vid 37 grader. Nästa dag, tvätta täcken tre gånger med sterilt vatten, kasta vattnet, och tillsätt 350 mikroliter av laminin lösningen vid en koncentration av 10 mikrogram per milliliter till varje brunn.

Placera i en inkubator, vid 37 grader i två timmar. Efter denna tid, och före cellplätering, ta bort lamininlösningen, och tvätta två gånger med 300 mikroliter av vanligt neurobasalt medium. Tillsätt 300 mikroliter av komplett medium, och placera i en inkubator, vid 37 grader och 5%CO2, tills du är redo att platta celler.

För dissekeringsproceduren behöver du, kycklingägg på embryonal dag sju, 75%etanol, dissektions-tynor nummer 545 och nummer 55, sax, en sked, dissekeringsspeti-rätter med svart botten och iskall HBSS-lösning. Se till att sterilisera alla dissektionsverktyg i 75%etanol. Ägg bör förvaras i 16 grader innan de ruvas i en ägginkubator, vid 37,7 grader, i sju dagar, eller annat önskat embryonalt stadium.

På dagen för förfarandet, ta bort äggen från ruvmaskinen, spraya äggen med 75%etanol. Få toppen av ägget med hjälp av en sax, och försiktigt ta ut embroy med hjälp av en sked. Placera embryot, i en petriskål med iskall HBSS-lösning, och omedelbart separera huvudet från kroppen, genom att skära i halsregionen.

Överför sedan huvudet till en ny petriskål med ren iskall HBSS-lösning. Så snart embryot avlägsnas från ägget, kan det producera proteaser som är ansvariga för celldöd. Så det är viktigt att skilja huvudet från kroppen så snabbt som möjligt, när embryot är utanför ägget för att minimera celldöd.

Det är också mycket viktigt att hålla chefen för embryot i iskall HBSS-lösning. Håll embryot huvudet upp, och fixa det i näbben av ungen, och sedan börja ta bort det tunna lagret av huden runt ögat. Försiktigt, ta bort ögat genom att försiktigt rotera bort det från huvudet.

Och medan separera ögat från huvudet på bruden, märker synnerven som är sektionerad. Håll ögat med den bakre sidan uppåt, och lägg märke till ciliär ganglion, intill sensorns synnerven och den koroida sprickan. Den preganglionska nerven kan fortfarande vara fäst vid ciliary ganglion, underlätta dess identifiering.

Dissekera ciliary ganglion, från varje öga, och rengör det mycket väl genom att ta bort överflödig vävnad. Överför de dissekerade ganglierna till en petriskål med HBSS-lösning på is. För att ha en avkastning på cirka 1 miljon celler per milliliter, bör du dissekera runt 70 ganglier, och även tänka på att cellpopulationen som erhållits, har icke-neuronala celler också, så för att minska antalet icke-neuronala celler, och även för att öka renheten hos din neuranala befolkning, är det viktigt att rengöra de ciliära ganglierna mycket väl , ta bort all överflödig vävnad.

För vävnaden dissociation, behöver du, en 24-Well platta, 0,1%tripsin lösning, ofullständig ciliary ganglier medium, en brand polerat glas pasteur pipetter, och en plast pasteur pipett. Pre-wet en steril plast pasteur pipetter, och samla alla ciliary ganglier till en 15 ML rör, och centrifug i två minuter vid 200 Gs.Försiktigt, ta bort alla HBSS medium, med hjälp av en pasteur pipet att ta bort en större volym, och sedan, när du är närmare pelleten, använda en mikropipett. Tillsätt en milliliter av 0,1%tripsin lösning, och inkubera i 20 minuter, i 37 grader i ett vattenbad.

Centrifugera i två minuter, vid 200 Gs.Omedelbart, ta bort tripsin-lösningen och tillsätt en milliliter av ofullständigt medium. Serumet i det ofullständiga mediet, kommer omedelbart att stoppa aktiviteten av trypsin. Centrifugera i två minuter, vid 200 Gs, och ta bort alla medium.

Tillsätt 500 mikroliter av komplett medium, och starta vävnadsupplösningen med hjälp av en P1000-mikropipette. Börja med pipettering upp och ner, 10 till 15 gånger, och sedan, byta till en brand polerat glas pasteur pipetter, och igen, pipett upp och ner 10 till 15 gånger. Cellen suspensionen bör bli suddig, som ett tecken på framgångsrik vävnadsuppdelning.

Den nödvändiga volymen för att dissociate celler beror på antalet ciliära ganglier som erhållits i detta, och pelleten storlek. När pipettering upp och ner för att separera en vävnad, är det viktigt att undvika bildandet luftbubblor, detta kommer att minimera cellförlust. Efter resuspending celler, kan du lämna cellen suspensionen på is tills plätering.

Bestäm celltätheten med hjälp av en trypan blå lösning, i neubauerkammaren. Att blycell suspension i komplett medium, med 5FTU, vid önskad densitet och platta 500 mikroliter celler per brunn. Inkubera celler i 37 grader och 5%CO2.

Se till att kontrollera vår kultur varje dag och följa utvecklingen av celler. Ciliary gangliceller utvecklas ganska snabbt in vitro, och efter en dag kan vi redan se några neuriter som sträcker sig från cellkroppen. Efter sju till åtta dagar in vitro, är det neuronala nätverket mycket väletablerat, och cellerna kan upprätthållas i minst 15 dagar.

Efter en dag in vitro, ciliary ganglion nervceller visar en multipolär mytologi. Dock neurites förlängning sker snabbt i nervcellerna synligt etablerade neuronala nätverket, redan efter 24 timmar. In vitro, ciliary ganglion nervceller är ansvariga för innervation av muskeln i ögat.

Och så, dessa neuronala kulturer, är mycket väl lämpade för studier av neuromuskulära synapser. För detta kan ciliary ganglion nervceller vara pläterad ovanpå muskelceller. Här, vi visar en framgångsrik kultur, av ögat glaskropp, CG nervceller, på toppen av ögat V7 chick pectral muskel nervceller.

Synaptic vesicle markör, SV2, visa aktiva synapser som är etablerade mellan CG nervceller axoner, och muskelfibrerna, lätt identifieras av de flera kärnor. Ciliary ganglion nervceller som erhållits med detta protokoll är lämpliga för immunocytochemistry, elektrofysiologi och överlevnad uppsatser bland andra. Detta dissekeringsprotokoll, ger ett mycket lågt antal nervceller, men om det görs på rätt sätt, kommer att ge den rena befolkningen av kolinerga nervceller.

Det är mycket viktigt att varje ganglierna är mycket väl rengjorda och överskottet vävnad avlägsnas. För det bör högkvalitativa instrument användas, så denna vävnad kan tas bort för att förhindra kontaminering av icke-neuronala celler. Embryots ålder kommer att avgöra framgången för vårt protokoll.

Helst ska dissektionen utföras mellan E7 och E8. Denna tidpunkt är mycket viktigt eftersom i detta skede, den utvecklingsmässiga celldöd som inträffar normalt in vitro har inte inträffat ännu. För att minimera kontamineringen av dessa icke-neuronala celler använder vi 5FTU i odlingsmedierna för att minimera tillväxten av gliaceller och fibroblaster. Denna cellmodell ger ett utmärkt alternativ för att studera din nueromusclar sjukdom.

Utifrån detta protokoll kan man ta upp ytterligare vetenskapliga frågor exempelvis hur subcelllokaliseringen av specifika karbonater och specifika proteiner reglerar synapsbildning och funktion. Dessutom, Det är ganska lätt att etablera nervmuskeln co-kulturer att ta itu med ytterligare frågor som studiet av neuromuskulära sjukdomar.