Visualisering af DNA Reparation Proteiner Interaktion ved Immunofluorescence

Indirekte immunfluorescens gør det muligt at opdage DNA reparation proteiner, fotos af rumlige og tidsmæssige rekruttering, og det hjælper forhør Proteinprotein interaktioner på stedet for DNA-skader. Efter DNA-skader rekrutteres DNA-reparationsproteiner til DNA-fornærmelsen, mens deres koncentration øges lokalt, og de danner grupper kaldet foci, der kan visualiseres ved indirekte immunfluorescens på faste prøver. Denne teknik kan bruges til at detektere protein foci, samt at kvantificere colocalization af den nuværende i celler.

Dette kan hjælpe med at forklare rækkefølgen af hændelser, der kræves for kompleks dannelse og til DNA-reparation. særlige proteinproteininteraktioner kan være forbundet med sådanne forsøg. Demonstrere proceduren vil være Barbara De La Pena, en meget talentfuld Postdoc Foto fra mit laboratorium Begynd med at dyrke 40.000 HeLa celler i hver langt over 12 godt plade med en 18 millimeter runde glas coverslip til 80% sammenløb.

Efter at cellerne er blevet udsat for fire grå gammabestråling, vaskes de to gange med en milliliter PBS. Fjern derefter PBS helt og tilsæt 200 mikroliter af NDB til hver brønd. Inkuber cellerne i to minutter ved stuetemperatur og fjern derefter NDB.

Husk, at inkubationstiden kan variere afhængigt af cellelinjen, men generelt bør ikke overstige to minutter. Cellerne vaskes med en milliliter PBS. Fjern derefter PBS helt og tilsæt 200 mikroliter på 4% PFA til hver brønd til cellefiksering.

Inkuber cellerne i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fjern derefter PFA og tilsæt en milliliter PBS til hver brønd. Fjern PBS helt og derefter tilføje 200 mikroliter af blokerende opløsning til hver brønd og inkubere cellerne i to timer ved stuetemperatur eller 16 til 18 timer ved fire grader Celsius.

fortyndet den primære antistof og fortynding buffer og vortex det indtil godt blandet i en fugtighed boks og her et stykke parafilm og tilsæt 10 mikroliter af primære antistof i en enkelt dråbe. Juster den ene kant af dækslæden fra brønden med dråben, og sænk langsomt den ned på parafilmen, der spreder væsken. inkubere dækslæbet i to timer ved stuetemperatur.

Efter inkubationen vaskes dækslet tre gange i PBS i 1 minut pr. vask. fortyndes det sekundære antistof og fortyndingsbufferen og vortex det, indtil det er godt blandet, påføres 10 mikroliter sekundært antistof på hver dækslæde som tidligere beskrevet og inkuberes den i to timer ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys. Dækslet vaskes tre gange med PBS og én gang med vand i 1 minut pr. vask.

Monter dem derefter på glasdias med et glycerolbaseret monteringsmedie, der indeholder DAPI-tætningsdækselssedler med gennemsigtig neglelak, og lad dem tørre i 20 minutter. Placer en dråbe nedsænkningsolie på 60 x objektivlinsen og brug DAPI til at finde kernerne gennem okularet til XYZ-billedopkøb, åbn anskaffelsessoftwaren, og indstil scannertypen som galvano scannertypen som rundtur og 512 x 512 billedstørrelse. I PMT-panelet indstilles tilstanden til VBM-gennemsnit til ramme og sekventiel scanning til linje.

Næste sæt farvestof og varme detektorer indstille kanal en til DAPI og SD en, kanal to til alexafluor 488 og HSD tre, og kanal tre til alexafluor på 647 og HSD fire vælge på at Z.To justere live-billedet, skal du trykke på live-knappen på live-vinduet og justere fokus. Brug derefter pmt-værktøjsvinduet til at indstille laserintensitetsfølsomhed, forstærkning og forskydning For z-stakke skal du vælge start til og 15 udsnit. Vælg den mappe, du vil gemme billeder, og tryk på LSM-startknappen for at begynde at anskaffe sig.

Når du er færdig, skal du trykke på knappen færdig med serien for at fuldføre anskaffelsen af billedet. Åbn analysesoftwaren, og tryk derefter på batchværktøjsvinduet, og vælg de billeder, der skal analyseres. Gå til analyseværktøjsvinduet, og vælg projektion, som viser den maksimale intensitetsprojektion fra 15 udsnit.

Vælg den oprettede batch- og outputmappe under inputoutputindstillingen. Tryk proces for billeder, der skal behandles og eksportere billederne som TIFF-filer. Udfør nuklear kvantificering med cellprofiler i henhold til manuskriptretninger.

Celler, der ikke behandles med stråling udviser meget få gamma H2AX expo tegn. I mangel af væsentlige DNA reparation proteiner, gamma H2AX akkumulering kan observeres ved DNA-brud. Akkumulering af ureparerede pauser kan føre celler til at blive præhyperiske indikeret ved fast gamma H2AX kerner.

Efter bestråling udviser kerner et stort antal dobbeltstrengede brud, som gamma H2AX lokaliserer ekstremt hurtigt. Mens få, hvis nogen foci er observeret i mangel af en stråling antallet af foci blev kvantificeret på en to fire og 16 timer efter en stråling og for NOA stråling kontrol. Afhængigt af det rejste biologiske spørgsmål og den type data, der kræves, bør forskellige plottemuligheder overvejes Colocalization kan undersøges ved multiplexing primære antistoffer rejst i forskellige dyrearter og ved hjælp af sekundære antistoffer, er mærket med forskellige fluorforeskånede.

Superposition af grøn og rød, giver anledning til gule hotspots, de to proteiner af interesse er til stede i de samme pixels. Kvantitativ analyse af colocalization kan opnås ved en objektbaseret tilgang eller ved en statistisk tilgang, der udfører intensitetskokorefficientbaserede analyser. En kombination af primære antistoffer, der er rejst i forskellige dyrearter, kan anvendes i denne protokol.

Sørg for, at antistofferne er kompatible og ikke forstyrrer hinanden. Du skal indstille det sekundære antistof, der skal anvendes, korrekt mod hvert af de primære antistoffer, og overveje en bestemt spektral overlapning, når du vælger den færre kraft, der skal anvendes. Kolokalkning eller proteiner indikerer mulige direkte interaktioner.

Dette kan verificeres ved granuleret udfældning i celler, eller ved direkte sat ned ved hjælp af rensede proteiner in vitro.