Fördröjd Intramyokardiell leverans av stamceller efter Ischemia Reperfusion Skada i en Murine Modell

Ischemisk skada inducerar en fientlig pro-inflammatorisk miljö som påverkar överlevnaden av transplanterade celler. Vårt protokoll presenterar en alternativ metod för att tillhandahålla biologiska läkemedel genom att kringgå det ursprungliga immunsvaret på skada. Den största fördelen med detta protokoll är att det gör det möjligt att administrera therapeutics en vecka efter skada, härma behandling i den kliniska miljön.

Vårt primära fokus ligger på ischemireperfusionsskademodellen och transplantation av STEM-celler. Detta tillvägagångssätt kan dock också utnyttjas för modeller av inflammatorisk sjukdom som innebär införandet av biologiska terapier. Börja med att autoklavera alla kirurgiska instrument.

Om flera operationer ska utföras i en session, rengör instrumenten efter varje djur och åter sterilisera dem med hjälp av en varm pärla sterilisator. Subkutant administrera smärtstillande, väg djuret, och mata in vikten i ventilatorn. Raka vänster sida av bröstet från bröstbenet till nivån på axeln och tillämpa avhårningskräm för att avlägsna överflödig päls.

För att förhindra lungkollaps, upprätthålla det positiva slutet expiratory trycket vid två centimeter vatten för ischemi reperfusion förfarandet och ändra den till tre centimeter vatten för fördröjd injektion av celler förfarande. Efter att ha sövt musen, intubate det med en 20 gauge endotrakeal tube och överföra den till en kontrollerad värmedyna för att upprätthålla en kroppstemperatur på 35 till 37 grader Celsius. Placera musen i lateral recumbency med kranial ände till vänster och caudal slutet till höger.

Skrubba det kirurgiska området omväxlande mellan povidone jod och sprit svabbarna tre gånger och tillämpa oftalmisk salva på båda ögonen. Använd ett nummer 10 blad skalpell för att göra en vertikal snitt 2,5 millimeter till höger om den vänstra bröstvårtan i synfältet, använd sedan sax för att skära igenom de ytliga muskellagren tills interkostalmuskeln och revbenen är synliga. Medan du lyfter revbenen och omgivande vävnad, skär genom det intercostal utrymmet mellan den fjärde och femte revben, sedan in ögonlocket upprullningsdon i det öppna utrymmet.

Dra tillbaka hjärtsäcken med hjälp av böjda tåtal, flytta lungan uppåt och ut ur vyn. Passera en 9-0 nylon sutur genom myokardiet under LAD artären 2,5 millimeter distala till vänster auricle upprätthålla jämn och konsekvent rörelse för att förhindra att riva av vävnaden eller punktera ett större blodkärl. Knyt en lös fyrkantig knut, sedan placera en centimeter av polyeten slangar inom den lösa knuten.

Säkra suturen runt slangen och bekräfta ischemi genom pallor och ventrikulär arytmi, släpp sedan efter 35 minuter. Efter att du har tagit bort slangen, vänta i fem minuter för att bekräfta re-perfusion av myokardiet. Placera en 24 gauge IV kateterrör i brösthålan ett intercostal utrymme till höger om öppningen.

Använd 6-0 resorberbara suturer för att stänga det intercostala snittet i ett enkelt avbrutet mönster och muskellagret i ett kontinuerligt suturmönster. Efter stängning av det ytliga muskellagret, avlägsna bröströret samtidigt som luften dras tillbaka från brösthålan med en milliliter tuberkulinspruta. Stäng huden snitt med en 6-0 resorberbar sutur i en kontinuerlig horisontell madrass mönster.

När du är klar, administrera 1,5 milliliter varm saltlösning subkutant och tillämpa trippel antibiotika salva till snittet platsen för att förhindra infektion. Överför musen till en sängkläder gratis bur eller en bur med täckt sängkläder på en varm pad och en temperatur på 35 till 37 grader Celsius tills den är helt återställd. Efter att ha förberett och intubera musen som tidigare beskrivits, ta bort suturen från hudlagret med sax och tlyck, använd sedan ett nummer 10 skalpell för att göra ett snitt på samma plats som den tidigare operationen.

Fortsätt att skära igenom ärrvävnaden tills muskelskiktet sutur är synlig, använd sedan saxen och tröt för att ta bort suturen och skär muskelskiktet öppna. Ta bort suturerna som håller ihop revbenen och fortsätt skära genom interkräsmuskeln från det tidigare snittet. Placera ögonlocksretraktorn i det interkonstala utrymmet och lokalisera området för den tidigare ligeringen.

Ladda 300, 000 mesenkymala STAMCELLER upphängda i 20 mikroliter pbs i en 30 gauge insulinspruta och böj nålen något för att uppnå rätt vinkel för injektion. Rör sig i riktning från apex mot hjärtats bas, sätt sprutan i regionen peri-infarkt tills nålöppningen är helt inne i hjärtmuskeln, sedan långsamt injicera cellerna i hjärtmuskeln, vänta tre sekunder och ta bort nålen. Observera hjärtat noga i tre minuter för att försäkra dig om att det inte finns någon onormal reaktion på cellerna såsom ventrikelflimmer.

Efter tre minuter, placera en 24 gauge IV kateterrör i brösthålan en intercostal utrymme till höger om öppningen. Stäng intercostalmuskeln och hudlagren och ta bort bröströret som tidigare beskrivits. Administrera 1,5 milliliter varm saltlösning subkutant och tillämpa trippel antibiotika salva till snittet för att förhindra infektion.

Överför musen till en sängkläder gratis bur eller bur med täckta sängkläder på en varm pad tills den är helt återställd. Post-operativ echocardiogram och elektrokardiogram utfördes på dagen fortsätter STEM cell implantation, bekräftar infarkt och minskade Ventrikulärt contractile funktion. Ytterligare undersökning av data visade utskjutningen fraktion och fraktionerad förkortning minskade i möss som fick ischemisk skada, medan slutet diastoliskt och systoliskt volymer ökade.

Masson trichrome färgning av hjärtinfarkt vävnad sju dagar post-skada visade ökad kollagen nedfall och gallring av vänster Ventrikulärt väggen i hjärtan av möss som fått skandinaviska skada. In vivo bioluminescent imaging eller BLI utfördes på dagen efter mesenchymal STEM cell implantation. Framgångsrik leverans av MSC exemplifieras av BLI-signalen jämfört med möss som hade inducerat ischemi reperfusion skada men fick inte MSC.

När du försöker detta protokoll, tänk på att små avsiktliga rörelser när du skär genom interkostalerna, ligting fartyget, och injicera celler är avgörande för att förhindra onödiga skador på hjärtat eller lungan i synfältet. Dessa förfaranden erbjuder förmågan att övervaka hjärtfunktionen efter transplantation genom ultraljud, cellens livskraft via bioluminescens avbildning, eller ytterligare molekylära eller biokemiska tekniker beroende på vilken terapi som används.