Login processing...

JoVE Journal
Bioengineering

This content is Open Access.

JoVE Journal Bioengineering

Manipulation af enkelt neurale stamceller og neuroner i hjernen skiver ved hjælp af Robotic Microinjection

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Journal (Bioengineering)

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Journal (Bioengineering)

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Click here for the English version

Manipulation af enkelt neurale stamceller og neuroner i hjernen skiver ved hjælp af Robotic Microinjection

Article DOI: 10.3791/61599-v

January 21st, 2021 •

Gabriella Shull*^1,2, Christiane Haffner*³, Wieland B. Huttner³, Elena Taverna^3,4, Suhasa B. Kodandaramaiah^1,5,6

¹Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, ²Department of Biomedical Engineering, Duke University, ³Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ⁴Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology, ⁵Department of Mechanical Engineering, University of Minnesota, ⁶Graduate Program in Neuroscience, University of Minnesota

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

January 21st, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokol viser brugen af en robot platform for mikroinjektion i enkelt neurale stamceller og neuroner i hjernen skiver. Denne teknik er alsidig og tilbyder en metode til sporing af celler i væv med høj rumlig opløsning.

Transcript

Denne teknik gør det muligt at give et nærmere kig på enkelte celler i levende væv. Ved at spore og manipulere enkelte celler, kan vi bedre forstå vævsdannelse under udvikling. Visuel demonstration af denne metode gør det muligt for potentielle brugere at afgøre, om denne teknik kan være nyttig for deres arbejde.

Derudover gør det det muligt for brugerne at se, hvordan programmet køres, hvilket ville være vanskeligt at forstå fra teksten alene. Denne protokol kan anvendes på alle væv med en vurderes overflade. Vi har været rettet mod forskellige celler i samme væv, forskellige væv i samme art, og også forskellige arter.

Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at forblive fokuseret og arbejde hurtigt. Alt udstyr skal tilberedes, før dissektionen påbegyndes. Begynd med at installere auto-injektor software og trække mikroinjection pipetter fra borosilikat glas kapillærer med mikropipette puller.

Opbevar pipetterne i op til tre dage beskyttet mod støv. Smelt 3% bred vifte agarose ved hjælp af en mikrobølgeovn. Lad ikke agarose størkne ved at holde det i et vandbad ved 37 grader Celsius.

Tø en aliquot en SCM og varm 10 til 12 milliliter SIM og 20 milliliter af Tyrod's opløsning til 37 grader Celsius ved hjælp af et vandbad. Bland fluorescerende sporstof med de andre kemikalier, der skal injiceres, derefter centrifuge mikroinjection opløsning ved 16, 000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Saml supernatant og overføre det til et nyt rør.

Hold mikroinfektionsopløsningen på is, indtil den er i brug. Brug hovederne fra E13.5 til E16.5 museembryoner til fremstilling af organotypiske vævsskiver af telencephalonen. Fjern huden og åbne kraniet med scelint bevæger sig langs midterlinjen.

Dissekere den embryonale hjerne ud af det åbne kranium og fjern de meninges, der dækker hjernevævet, startende fra hjernesiden. Efterlad den dissekerede hele hjernen i Tyrods opløsning på 37 grader Celsius varmeblok. Hæld den brede vifte smeltet agarose i en engangs indlejring skimmel.

Når det køler til 38 til 39 grader Celsius, omhyggeligt overføre op til fire hjerner i agarose ved hjælp af en Pasteur pipette. Rør agarose omkring vævet med en spatel eller et par Dumont nummer et stænde uden at røre vævet. Lad agarose størkne ved stuetemperatur.

Når agarose har størknet, trimme overskydende omkring vævet. Fyld bufferbakken med PBS. Orient hjernen med rostral haleakse af vævet vinkelret på bakken og skær 250 mikrometer skiver ved hjælp af en vibratome.

Fyld en 3,5 centimeter petriskål med to milliliter forvarmte medier, og brug derefter en plastik Pasteur pipette til at overføre 10 til 15 skiver til denne skål. Når du er færdig, overføre petriskålen med skiverne i skiven kultur rugemaskine. Vedligehold skiverne ved 37 grader Celsius i en befugtet atmosfære.

Tænd computeren, mikroskopet, mikroskopkameraet, manipulatorer, trykplatformen og tryksensoren. Indlæse programmet ved at klikke på filen, starte app.py i hovedmappen hentet fra GitHub og angive enhedsindstillingerne i popup-skærmen.

For at undgå uønsket tilstopning skal der skabes et udadgående tryk, før pipetten nedsænkes i opløsningen. Skub kompensationstryklinjen til 24 til 45 %, og klik på sætværdier. Dernæst indstilles trykket ved at dreje den mekaniske trykventilknap til en til to PSI som angivet af tryksensoren.

Overfør skiverne til midten af en 3,5 centimeter petriskål, der indeholder to milliliter forvarmet SIM, og placer derefter petriskålen på mikroinjektionsfasen, der er blevet forvarmet til 37 grader Celsius. Mikroinfektionpipetten indlæses med 1,4 til 1,6 mikroliter af mikroinjektionsopløsning med en lang spidssplastpipette, og sæt mikroinjektionspipetten ind i pipetteholderen. Brug den laveste forstørrelse på mikroskopet, bring skiven i fokus og før mikropipetten til dette synsfelt, så den er fokuseret på det samme plan som skivemålet.

Skift mikroskopets udgang til kameraet for at se FOV og applikationen. Klik på forstørrelsesknappen øverst til venstre i grænsefladen for at starte enhedskalibrering. Når et vindue bliver bedt om at vælge forstørrelsen, skal du markere 10X og trykke på OK. Softwaren antager den interne objektive linse er 10X.

Refokuser pipettespidsen ved hjælp af mikroskopets mikrometriske hjul, og klik på pipettespidsen med markøren. Tryk derefter på trin 1.1-knappen, og tryk på OK i pop op-vinduet. Pipetten bevæger sig i y-retning.

Klik på spidsen af pipetten, og tryk på trin 1.2-knappen. Endelig skal du indtaste 45 i pipetten vinkel boksen og tryk på sæt vinkel. Indtast ønskede parametre i det automatiske mikroinjektionskontrolpanel, og indstil hastigheden til 100 %Når du er færdig, skal du klikke på sætværdier.

Klik på knappen Tegn kant, og træk markøren langs den ønskede bane i pop op-vinduet for at definere injektionens bane. For mikroinjecting neuroner, målrette basal side af telencephalon. Bring pipetten til starten af linjen og klik på dens spids, og klik derefter på køre bane for at starte microinjecting.

Gentag dette trin for hvert fly af injektion målrettet. Nedsænk skiverne i kollagen blandingen, derefter overføre skiver sammen med 200 til 300 mikroliter af kollagen i en 14 millimeter godt af en 35 millimeter glas bund skål. Sørg for, at skiverne er dækket i den mindste mængde kollagen muligt, hvilket er den optimale tilstand for næringsstoffer og iltoptagelse.

Orient skiverne ved hjælp af to par stæcener og inkubere petriskålen i fem minutter ved 37 grader Celsius på en varmeblok for at gøre det muligt for kollagen at størkne. Flyt petriskålen tilbage til skivens kulturkubvøse i yderligere 40 minutter, og tilsæt derefter to milliliter forvarmt SCM. I slutningen af kulturen, tage skiver ud af skiven kultur inkubator og aspirere SCM.

Vask kollagen-indlejrede skiver med PBS, tilsæt derefter 4% paraformaldehyd og lad vævet ved stuetemperatur i 30 minutter. Flyt den til fire grader Celsius for natten fiksering. Den næste dag aspirere paraformaldehydopløsningen og skiverne vaskes med PBS.

Fjern skiverne fra kollagen med to par vicesser under et stereomikroskop. Brug en mikrobølgeovn til at smelte 3% lavt smeltepunkt agarose, derefter hælde det i en engangs indlejring skimmel og lad det køle af til ca 38 eller 39 grader Celsius. Overfør vævsskiverne i denne form og sørg for, at skrælsiden af skiven vender opad, og lad derefter agarose afkøle til stuetemperatur og størkne.

Trim den ekstra agarose omkring skiverne. Vend agaroseblokken for at sikre, at snitfladen er parallel med vibratomens skæreblad og skær 50 mikrometer tykke sektioner. Fyld en 24-brønd skål med PBS og overføre sektioner i denne parabol ved hjælp af en fin-tip pensel, derefter udføre immunfluorescens i henhold til standard protokoller.

Repræsentative billeder af vellykket injiceres stamcelle og nyfødte neuroner er vist her. Når injiceres med Dextran Alexa 488, celler synes fuldt fyldt med farvestoffet. Automatiseret mikroinjektion kan give betydeligt højere gennemløb sammenlignet med manuel mikroinjektion.

Endvidere bekræfter EDU-mærkningen, at cellernes levedygtighed ikke påvirkes af automatisering. Ved at holde den organotypiske skive i kulturen kan man følge de mikroopterede cellers afstamning. Microinjection i enkelte neurale stamceller giver fremragende enkelt celle opløsning.

Derfor har det været brugt til at dissekere cellebiologi af neurale stamceller progression og skæbne overgang. Denne protokol blev brugt til at studere junctional kobling i nyfødte neuroner ved at injicere Lucifer gul sammen med Dextran A555. En del af nyfødte pyramideformede neuroner blev koblet via hul kryds til tilstødende neuroner, hvilket er i overensstemmelse med tanken om, at umodne neuroner kommunikere via gap krydset.

Vi har brugt denne teknik til at undersøge cellebiologi af hjernens udvikling og hjernens udvikling. Vi studerede flere kandidat gener, der påvirkede neurale stamceller adfærd, og vi var i stand til at opdage og forstå, hvordan de virker, hvordan de påvirker neurale stamceller afstamning progression, og neuron produktion under hjernens udvikling.

X

Simple Hit Counter