भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत सेल संस्कृतियों की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग भेदभाव और परिपक्वता विश्लेषण

प्रोटोकॉल तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न सहज मिश्रित संस्कृतियों के आयु-विशिष्ट अलगाव को जोड़ती है जिसमें ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स को अलग किया जाता है, रोग की स्थिति की नकल करते हुए, और मजबूत, उच्च सामग्री readouts कहते हैं। ये विशेषताएं शारीरिक और रोग स्थितियों में और एस्ट्रोसाइट्स के योगदान को ध्यान में रखते हुए एक माइक्रोएनवायरमेंट में विकासात्मक माइलियन और वयस्क पुनर्जंमीकरण का अलग-अलग अध्ययन करना संभव बनाती हैं। भ्रूण दिन 13.5 से 14.5 भ्रूण पूर्वाभास से तंत्रिका स्टेम सेल अलगाव के लिए, भ्रूण के सिर को बर्फ ठंडे पीबीएस के साथ एक साफ पेट्री डिश में रखें और आवर्धन के तहत खोपड़ी से त्वचा को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।

एक बार जब मस्तिष्क दिखाई देता है और त्वचा से साफ हो जाता है, तो मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर निचोड़ने और सेरिबैलम को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। मेनिंग्स को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें और अलग-अलग ऊतकों को गैर-एंजाइमेटिक वियोजन बफर में रखें। जब मस्तिष्क के ऊतकों के सभी अलग किया गया है, गैर एंजाइमेटिक वियोजन बफर प्रति १.५ मिलीलीटर ट्यूब के १५० माइक्रोलीटर में दो से तीन नमूने खींच, और लगातार मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों इनक्यूबेट ।

इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक ट्यूब और पिपेट में मानक माध्यम के 850 माइक्रोलीटर जोड़ें जब तक निलंबन झुरमुट से मुक्त न हो जाए। यदि गैर-वियोजन ऊतक अभी भी दिखाई दे रहा है, तो नमूनों को दो मिनट तक आराम करने की अनुमति दें ताकि ऊतकों को ट्यूबों के नीचे बसने की अनुमति मिल सके। जब वियोजन पूरा हो जाता है, तो टी-25 या टी 45 फ्लास्क में न्यूरोस्फीयर मध्यम एकाग्रता के 10 से 30 मिलीलीटर में प्रति माइक्रोलीटर 10 से 50 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं, और कोशिका लगाव को रोकने के लिए कोशिका संस्कृति इनक्यूबेटर में फ्लास्क रखें।

२.५ महीने पुराने वयस्क चूहों से, चार से पांच वयस्क चूहों से बर्फ ठंडे HBSS के एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में दिमाग जगह है और एक मस्तिष्क, वेंट्रल साइड नीचे जगह, एक बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी पर रोस्ट्रल-कौदल दिशा में-कवर कुप्पी शूंय से भरा 20 डिग्री सेल्सियस रात भर ठंडे पानी । घ्राण बल्ब को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें और कॉर्टेक्स से ऑप्टिकल चिस्मा में दो से ३ मिलीमीटर मोटी कोरोनल स्लाइस काटें। स्लाइस को ठंडी सतह पर एक वेंट्रो-पृष्ठीय स्थिति में रखें, और कॉर्पस कैलोसम और दो पार्श्व वेंट्रिकल्स की पहचान करें।

आवर्धन का उपयोग करके, पार्श्व वेंट्रिकल्स की दीवारों को अलग करें, इस बात का ध्यान रखें कि कॉर्पस कैलोसम के टुकड़े शामिल न हों, और अलग-थलग ऊतक को 15 मिनट के लिए एंजाइमैटिक वियोजन बफर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों इनक्यूबेटिंग से पहले ऊतकों को कम से ५० बार पिपेट करें । इनक्यूबेशन के अंत में, मानक संस्कृति माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ ट्रिपसिन को बेअसर करें और 70-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से ऊतक निलंबन को फ़िल्टर करें।

400 बार जी पर पांच मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए समाधान को अपकेंद्रित्र करें, और एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए सुक्रोज समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें। अपकेंद्रित्र के अंत में, एक और अपकेंद्रित्र के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन वाशिंग समाधान में गोली को फिर से निलंबित करें, फिर एक ईमानदार टी-25 या टी-४५ फ्लास्क में कोशिकाओं की गिनती और प्लेट के लिए मानक संस्कृति माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें । प्राथमिक न्यूरोस्फीयर भेदभाव के लिए, हर दो दिनों में तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति में बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल विकास कारक जोड़ें।

जब न्यूरोस्फीयर 100-से 500-माइक्रोन व्यास तक पहुंचते हैं, तो मानक प्रोटोकॉल के अनुसार यांत्रिक वियोजन द्वारा कोशिकाओं को पारित करते हैं। अल्पामंडल भेदभाव के लिए, हर दो दिन प्लेटलेट-व्युत्पन्न कारक-एए में बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। जब ओलिगोस्फीयर 100 से 150-माइक्रोन व्यास तक पहुंचते हैं, तो मानक प्रोटोकॉल के अनुसार यांत्रिक वियोजन द्वारा क्षेत्रों को अलग करें और पॉली-डीएल-ऑर्निथिन लेपित प्लेटों पर 3000-सेल प्रति वर्ग सेंटीमीटर घनत्व पर सेल निलंबन को बीज करें।

तीन दिनों के बाद, प्रत्येक संस्कृति के सुपरनैंट को ओलिगोडेन्ड्रोसाइट विभेदन माध्यम की एक ही मात्रा के साथ प्रतिस्थापित करें। न्यूरोस्फीयर वियोजन और अल्पामंडल उत्पादन के दौरान, सूजन-मध्यस्थता विभेदन ब्लॉक प्रेरण करने के लिए, संस्कृति माध्यम में ब्याज का साइटोकिन मिश्रण जोड़ें। ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने के लिए, बहु-अच्छी प्लेटों में बोने के दो दिन बाद, प्रत्येक संस्कृति से सुपरनैंट को एक बहु-अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें।

कुओं में ओजीडी माध्यम की आधी मात्रा जोड़ें, और संस्कृतियों को 95% नाइट्रोजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ संतृप्त एक एयरटाइट हाइपोक्सिया कक्ष में स्थानांतरित करें। कक्ष को कक्ष संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें। तीन घंटे के बाद, कक्षों में माध्यम को बहु-वेल कल्चर प्लेट से अलग सेट माध्यम से बदलें।

सेल धुंधला की गुणवत्ता की जांच करने के बाद, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग सॉफ्टवेयर के अधिग्रहण मेनू में, फिक्स्ड एक्सपोजर समय और मिनी स्कैन का चयन करें, और क्षेत्रों के सबसेट में विश्लेषण मापदंडों को पूरी प्लेट के लिए निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए प्रति अच्छी तरह से और दो कुओं प्रति प्रयोगात्मक स्थिति का चयन करें। पूरे एल्गोरिदम को विकसित करने के लिए कार्यप्रवाह कदम-दर-कदम का पालन करें। प्रत्येक चैनल के लिए प्रक्रिया छवि का चयन करें और सिग्नल के वांछित स्तर का चयन करने के लिए पृष्ठभूमि हटाने पर क्लिक करें।

परमाणु धुंधला द्वारा नाभिक की पहचान और चयन करने के लिए, प्राथमिक वस्तु की पहचान करने पर क्लिक करें, एकल नाभिक की पहचान करने के लिए दहलीज को समायोजित करें, और ऑब्जेक्ट क्षेत्रों और स्थिति के आधार पर थ्रेसहोल्ड सेट करने के लिए प्राथमिक वस्तुओं को मान्य करें पर क्लिक करें। क्लिक करें विशिष्ट वंश मार्कर के अनुरूप प्रत्येक चैनल के लिए स्पॉट की पहचान करें, और साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस की पहचान की अनुमति देने के लिए रिंग वैल्यू चौड़ाई को तीन और शून्य तक की दूरी निर्धारित करें। विश्लेषण बनाने के लिए वर्कफ़्लो में संदर्भ स्तरों का चयन करें और परमाणु आकार और परमाणु धुंधला तीव्रता और अंगूठी द्वारा पहचाने गए साइटोप्लाजेटिक फ्लोरेसेंस के आधार पर विशिष्ट मार्कर-सकारात्मक कोशिकाओं के आधार पर संघनित नाभिक की स्वचालित गिनती की अनुमति दें, फिर प्ले पर क्लिक करें।

संस्कृति के पहले चरण के दौरान, तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं अपने नेस्टिन अभिव्यक्ति को बनाए रखते हैं। अधिकांश कोशिकाएं भी NG2-सकारात्मक हैं। पूर्व-ओलिगोडेन्ड्रोसाइट चरण के अनुरूप CNPase-सकारात्मक कोशिकाओं T3-मध्यस्थता विभेदन प्रेरण के तीन से छह दिनों के बाद पता लगाने योग्य हैं, जबकि परिपक्व MBP-सकारात्मक ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स विट्रो में छह से 12 दिनों के बाद एक महत्वपूर्ण प्रतिशत में दिखाई देते हैं ।

उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विश्लेषण परमाणु धुंधला और फ्लोरेसेंस तीव्रता विश्लेषण के माध्यम से संस्कृति के भीतर एकल कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है । भेदभाव चरण के अंत में संस्कृति की संरचना इस बात पर निर्भर करती है कि क्या संस्कृतियां भ्रूण या वयस्क मूल की हैं, भ्रूण संस्कृतियों के साथ T3-मध्यस्थता भेदभाव के लिए अधिक उत्तरदायी हैं, और परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स के उच्च प्रतिशत तक पहुंचते हैं। ध्यान दें कि जब तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेनड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर वरीयता दी जाती है, तो वे कुल होते हैं, और एस्ट्रोसाइट्स को दोहराते हुए तेजी से एक ढुलमुल कोशिका परत का उत्पादन करते हैं, जो परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स के विशिष्ट मकड़ी शुद्ध आकार के अवलोकन को रोकते हैं।

सूजन-मध्यस्थता, भेदभाव अवरुद्ध पूर्व और परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में एक मजबूत कमी लाती है, जैसा कि भ्रूण और वयस्क दोनों संस्कृतियों में CNPase और MBP धुंधला द्वारा पता लगाया गया है। ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि भी साइटोकिन-इलाज वयस्क संस्कृतियों में होती है। जबकि भ्रूण और वयस्क ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं भड़काऊ साइटोकिन एक्सपोजर के समान दिखाई देती हैं, केवल भ्रूण-व्युत्पन्न संस्कृतियां ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव विषाक्तता के प्रति संवेदनशील होती हैं।

विधि को किसी भी प्रकार की ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं, भेदभाव और परिपक्वता हस्तक्षेप प्रक्रिया के साथ लागू किया जा सकता है, ताकि माइलियनेशन या रेमाइलेशन को प्रभावित करने वाली बीमारियों से लड़ने के उद्देश्य से नई रणनीतियों का परीक्षण किया जा सके।