Cryo-Elektron mikroskopiska rutnät förberedelse för tidsuppgjorda studier med hjälp av ett nytt robotsystem, Spotiton

Med hjälp av Spotitons robotsystem kan man blanda och vitrify ett protein av intresse med en interagerande partner på ett elektronmikroskopnät på så snabbt som 90 millisekunder. Detta protokoll gör det möjligt att fånga in mellanliggande proteinbekräftelser som är för övergående för att fångas av standardtekniker för nätberedning. Tids löst Spotiton kan informera sub-second biologiska eller biokemiska system såsom membran kanal aktivering, DNA eller RNA syntes, eller tidig interaktion av ett läkemedel eller antikroppar med dess målprotein.

Användaren måste samtidigt hantera flera komponenter som direkt påverkar kvaliteten på ett rutnät. Det är viktigt att förstå systemet innan du använder och ha tålamod när du förbereder rutnät. Till att börja med, öppna huvudventilen på kvävetillförseltanken och se till att systembehållaren är fylld med avgasat ultrapurvatten.

Slå på datorn och Spotiton-systemet på strömremsan med flera uttag. Klicka på skrivbordsikonen för att öppna användargränssnittet för Spotiton-programvaran. I Verktyg-menyn väljer du Initiera steg för att initiera och hem de tre axelrobotarna och roterande dispenserhuvudenheten, vilket säkerställer att dispenserspetsarna pekar nedåt före initiering och lokalisering.

På huvudmenyn klickar du på Gå till säker position för att skicka robotarna till säker position. På fliken Aspirate väljer du Prime för att spola dispenserhuvudena flera gånger med vatten från behållaren. Fortsätt tills två oavbrutna vattenströmmar kan ses komma ut ur spetsarna.

På fliken Inspektera, skicka tips ett till inspektionskameran och testa brandvatten, justera amplituden tills diskreta droppar produceras. Tryck på knappen Spela in i den övre kameramonitorn för att spela in en video med dricks ett som avfyras. Skicka tips två till inspektionskameran.

Spela upp videon med tip one som skjuter i höger sidomonitor samtidigt som spets två avfyras i den övre kameramonitorn, som matchar mönstret för droppproduktion från de två dispensrarna. Ta bort pincetterna från fästet på nätroboten med den medföljande insexnyckeln. Placera en nanotrådssida upp på kanten av gallerblocket på en närliggande bänkskiva.

Ta försiktigt tag i gallrets kant och placera den korrekt i pincetten. Sätt sedan tillbaka pincetten. På fliken Cryo klickar du på Tips till kamera för att flytta tips ett till synfältet på den övre avsvalkningsbanans kamera, vilket säkerställer att Live är markerat i den övre kameramonitorn.

Tänd och justera den övre kameralampan. Placera spetsen ett synligt i den övre kameramonitorn genom att klicka på musen i bildskärmen. Klicka på Rutnät till Kamera för att placera rutnätet framför den övre kameran och justera sedan spetsen en position igen om det behövs.

På fliken Cryo kontrollerar du att Vitrified Grid inte är markerat, klickar på Kömål och sedan på Plunge. Utvärdera de övre och nedre bilderna för att bekräfta att dispensrarna fungerar normalt. Späd två prover till önskade koncentrationer med en lämplig buffert, helst med samma för båda, och fyll kryogenskålen med flytande kväve.

Plasma rengör tre till fyra nanotrådsnät med fem watt väte och syre och 1,5 minuter som utgångspunkt. Anslut nebulisatorn och observera ångan som lämnar nebulisatorlockens centrala port. Observera monitorn för luftfuktighet i huvudfönstret eller öppna spåraren för omgivningsfuktighet under Rapporter och Omgivande.

Kontrollera luftfuktigheten i kammaren och svepzonerna. Tillsätt fem mikroliter av varje prov i provkopparna. Ladda provkopparna i hållbrickan med ett prov för spets ett till vänster och för spets två till höger.

Tryck sedan tillbaka brickan i maskinen tills den sitter. På fliken Aspirate väljer du tre mikroliter för volymen som ska aspireras av varje spets. Se till att provbrickan sitter ordentligt, klicka på Aspirera och observera att pipettsteget flyttar dispenserhuvudena till provkopparna.

Kontrollera att båda proverna har lyckats genom att ta bort provkopparna och observera en minskning av vätskenivåerna. På fliken Inspektera skickar du varje tips till inspektionskameran för att bekräfta fri dispensering. Justera amplituden efter behov för att matcha droppformationen från varje spets.

Ladda ett nyrengjort rutnät i pincetten, men montera inte pincetten ännu. Se till att luftfuktigheten är förhöjd till cirka 90 till 95%Fyll etankoppen och utför en slutlig testbrand av båda spetsarna framför inspektionskameran, vilket bekräftar inget hinder. Klicka på Tips till kamera på fliken Cryo.

Kolla etankoppen. Om etanis har bildats, smält efter behov med ytterligare etangas. Montera pincetterna med gallret på rutnätsscenen.

På fliken Cryo klickar du på Grid to Camera och ser till att tips ett är korrekt placerat i den övre kameramonitorn. Klicka på Vitrified Grid, Kömål och sedan Plunge. Klicka på OK när du uppmanas att befalla nätroboten att hoppa över nätet från etan till flytande kväve och släppa ut det på den nedsänkta hyllan.

Undersök bilder av rutnätet för att avgöra om det ska behållas eller kasseras. Om du behåller gallret, förkylda finspetsade tångar, ta försiktigt tag i gallret vid kanten och placera det i ett gallerboxfack, börja med den första öppningen till vänster om skåran och gå medurs. Använd Experimentvisaren för att granska och jämföra rutnätsbilderna från de övre och nedre kamerorna tillsammans med maskininställningarna och fuktmätningarna vid tidpunkten för doppet genom att välja Rapporter och experiment.

Bilder av galler som förberetts under en enda tidsupplösen Spotiton-session genom att blanda RNA-polymeras i ett 105-baspar DNA-oligomer som bär en promotorsekvens i 150 millisekunder före vitrifiering visas här. Av de sex rutnäten visar bara ett suboptimalt transporter. Mönstret av is nedfall på ett förglasat rutnät matchar nära mönstret av deponerad vätska sett i den övre kamerabilden.

Effektiv transportering av de blandade proverna sker längs de nanotrådstäckta gallerstängerna där provet sällan svämmar över i rutor intill de där det landade. I isfyllda rutor är isen vanligtvis tjockast i hål i mitten av torget och blir tunnare i hål närmare gallerstängerna. Hål omedelbart intill gallerstängerna är ofta tomma på grund av närheten till nanotrådarna.

Korrekt beredning och hantering av nanotrådsnäten säkerställer god istjocklek på blandade provnät. Spotiton-systemet gör det också möjligt för användaren att deponera de två proverna separat på ett enda rutnät, vilket möjliggör insamling av en oblandad kontroll under samma rutnätsunderhållssession. Spotiton har möjliggjort fångsten av de första intermediärerna i bakteriellt genuttryck i realtid.

Eftersom de bildas på en andra tidsskala har deras strukturer hittills varit okända.