Biology
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Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Calciumdynamik in akuten Pankreasgewebeschnitten der Maus
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Summary April 13th, 2021
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Wir präsentieren die Herstellung von akuten Pankreasgewebeschnitten und deren Verwendung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, um die Calciumdynamik gleichzeitig in einer großen Anzahl lebender Zellen, über lange Zeiträume und mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen.
Transcript
In Kombination mit der Live-Cell-Calcium-Bildgebung ermöglicht die akute Pankreas-Gewebeschnitttechnik die Untersuchung von interzellulären Wellen und multizellulärer funktioneller Konnektivität mit einer hohen Auflösung über lange Zeiträume. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell ist, die Gewebearchitektur bewahrt und begrenzte enzymatische und mechanische Spannungen reduziert, während sie eine hohe Gewebeausbeute beibehält. Durch die Erkennung funktioneller und morphologischer Veränderungen während des Krankheitsverlaufs hilft diese Technik unserem Verständnis der Pankreaserkrankungen wie Diabetes.
Diese Gewebeschnitttechnik kann auf Gehirn-, Hypophysen- und Nebennierengewebe angewendet werden, wobei der Schwerpunkt auf der Erhaltung des interzellulären Kontakts, parakriner Interaktionen und der Gewebearchitektur liegt. Um sich auf die Injektion von Agarose in die Bauchspeicheldrüse der Maus vorzubereiten, füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit 40 Grad Celsius flüssiger Agarose und statten Sie die Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel aus. Nachdem Sie die Nadel vorsichtig mit einer Kappe bedeckt haben, legen Sie das Spritzennadelende mit dem gesamten Volumen der Agarose unter der Wasseroberfläche in ein 40 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Blasen Sie eine Flasche extrazelluläre Lösung mit Carbogen, kontinuierlich auf Eis, mit 1,5 Millilitern pro Minute bei Luftdruck und Raumtemperatur, um eine Sauerstoffversorgung und einen pH-Wert von 7,4 zu gewährleisten. Um die Agarose-Injektion durchzuführen, legen Sie eine eingeschläferte erwachsene Maus unter ein Stereomikroskop und greifen Sie per Laparotomie auf den Mausbauch zu. Bewegen Sie den Darm vorsichtig auf die linke Seite, um den gemeinsamen Gallengang freizulegen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das Zwölffingerdarmende des Kanals leicht anzuheben, um die Papille von Vater zu lokalisieren.
Verwenden Sie einen Hämostat, um den Gallengang an der Zwölffingerdarmpapille zu klemmen, um ein Austreten der Agarose aus dem Kanal in den Zwölffingerdarm zu verhindern, und verwenden Sie eine kleine scharfe Pinzette, um unter den gemeinsamen Gallengang zu gelangen, um die Membran zu brechen, die den Kanal am Pankreasgewebe befestigt. Nachdem Sie so viel Fett und Bindegewebe wie möglich aus dem Kanal entfernt haben, legen Sie den Kanal senkrecht auf die Spitzen einer größeren Pinzette und drücken Sie fest auf den Spritzenkolben, injizieren Sie die viskose flüssige Agarose für 20 bis 30 Sekunden in das proximale Ende des gemeinsamen Gallengangs. Wenn das Gewebe weißlich und leicht aufgebläht wird, entfernen Sie die Spritze und gießen Sie langsam 20 Milliliter der sprudelnden eiskalten extrazellulären Lösung auf die Bauchspeicheldrüse, um das Gewebe zu kühlen und die Agarose zu härten.
Um Pankreasgewebescheiben zu erhalten, verwenden Sie eine Pinzette und eine feine, zähe Schnittschere, um die injizierte Bauchspeicheldrüse mit Agarose sanft in eine 100-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die 40 Milliliter eiskalte extrazelluläre Lösung enthält. Schwenken Sie die Schale, um das Gewebe zu spülen, und übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine zweite Schale eiskalter extrazellulärer Lösung. Schneiden Sie mit der Pinzette und der Schere den weißlichen, gut injizierten Bauchspeicheldrüsenabschnitt in bis zu sechs 0,1 bis 0,2 Kubikzentimeter große Stücke und entfernen Sie verbleibendes Binde- und Fettgewebe aus den Gewebestücken.
Die gereinigten Blöcke in eine 35 Millimeter schwere, nicht klebrige Boden-Petrischale mit etwa fünf Millilitern 40 Grad Celsius flüssiger Agarose geben und die Petrischale sofort auf Eis legen. Wenn die Agarose ausgehärtet ist, halten Sie die Petrischale kopfüber über den Deckel einer 100 Millimeter großen Petrischale und schneiden Sie mit einer halben Rasierklinge vorsichtig in den Rand zwischen der Seitenwand der Petrischale und der Agarose, um die Agarose aus der Schale zu entfernen. Verwenden Sie die Rasierklinge, um einzelne Würfel, die jeweils einen Gewebeblock Agarose enthalten, aus der befreiten Agarose zu schneiden und verwenden Sie Cyanacrylatkleber, um die Blöcke an der Probenplatte eines Vibratoms zu befestigen.
Füllen Sie die Schneidkammer des Vibratoms mit 150 Millilitern eiskalter extrazellulärer Lösung, die kontinuierlich mit Carbogen aufgeblasen wird. Schrauben Sie die Probenplatte auf das Vibratom und montieren Sie eine neue Rasierklinge. Umgeben Sie die Kammer mit Eis und fügen Sie zwei 10-Milliliter-Volumen-Eiswürfel hinzu, die mit extrazellulärer Lösung hergestellt werden, die mit sechs Millimolaren Glukose ergänzt wird.
Stellen Sie den Slicer auf 0,05 bis 1 Millimeter pro Sekunde und 70 Hertz ein und beginnen Sie dann mit dem Schneiden, um 140 Mikron dicke Agarosescheiben mit einer Oberfläche von 20 bis 100 Quadratmillimetern zu erhalten. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um jede Scheibe vorsichtig in eine 100-Millimeter-Petrischale zu geben, die mit 40 Millimetern HEPES-Puffer gefüllt ist, ergänzt durch sechs Millimolare Glukose. Für die Herstellung von Calciumfarbstoffen werden 50 Mikrogramm zelldurchlässiger Calciumindikatorfarbstoff, 7,5 Mikroliter DMSO und 2,5 Mikroliter Poloxamer sowie 6,667 Milliliter HBS in einem 15-Milliliter-Schraubverschlussrohr gelöst.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung 20 Sekunden lang gründlich zu mischen, bevor Sie das Rohr in eine Ultraschallbadkammer tauchen und jeweils 30 Sekunden lang wirbeln. Dann aliquot 3,333 Milliliter der resultierenden Calciumindikator-Farbstofflösung in eine 5 Milliliter Petrischale pro 10 Scheiben Gewebe zu etikettieren. Verwenden Sie zum Aufladen des Farbstoffs einen dünnen weichen Pinsel, um bis zu 10 Gewebescheiben auf jede Schale mit Farbstofflösung zu übertragen, und legen Sie die Schalen für 50 Minuten bei Raumtemperatur und 40 Umdrehungen pro Minute vor Licht geschützt auf einen Orbitalschüttler.
Am Ende der Inkubation bis zu 20 gefärbte Scheiben in einzelne 60-Milliliter-Petrischalen geben, die mit farbstofffreiem HBS gefüllt sind. Für die Kalziumbildgebung durch konfokale Mikroskopie wählen Sie eine 20- oder 25-fache Vergrößerung und stellen Sie den Erfassungsmodus auf Zeitraffer-Bildgebung, das Loch auf 100 bis 200 Mikrometer und die Anregung und Emission für das im Experiment verwendete Fluorophor ein. Montieren Sie die Aufnahmekammer und das Perfusionssystem auf dem temperaturgesteuerten Tisch des Mikroskops und positionieren Sie den Ein- und Auslass an den äußersten Rändern der Aufnahmekammer.
Stellen Sie die Zu- und Abflussraten auf ein bis zwei Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie die Temperatur des Füllkörpersystems auf 37 Grad Celsius ein und initiieren Sie die Fülle mit der nicht-stimulierenden Lösung. Um die Kalziumdynamik des Gewebes aufzuzeichnen, legen Sie eine einzelne Gewebescheibe in die Aufnahmekammer und immobilisieren Sie das Gewebe mit einem U-förmigen Platingewicht mit einem straffen Nylonnetz.
Verwenden Sie die Hellfeldoption, um die gewünschte Struktur zu lokalisieren, und verwenden Sie Live-Bildgebung, um die untersuchten Strukturen im Sichtfeld zu positionieren. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren, passen Sie die Laserleistung, die Detektorverstärkung und das Line-Averaging Binning an, während die Laserleistung minimal gehalten wird. Stellen Sie die Brennebene auf 15 Mikrometer unter der Schnittfläche ein, um die Aufnahme von potenziell beschädigten Zellen zu vermeiden, und erfassen Sie die Bilder.
Einstellung der Abtastfrequenz auf ein bis zwei Hertz, um die anfängliche Erkennung einzelner Schwingungen und die Aufnahme eines hochauflösenden Bildes zu ermöglichen. Falls verfügbar, verwenden Sie ein Online-Diagramm, um sofortiges Feedback zur Vorbereitungsreaktion, zur Überbeleuchtung, zum Fotobleichen und zur mechanischen Drift zu erhalten. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, speichern Sie die Daten für eine spätere Analyse.
Hier kann ein Beispiel für eine optimale Gewebescheibe beobachtet werden, bei der der zelldurchlässige Calciumindikatorfarbstoff erfolgreich in die Pankreasgewebescheibe geladen wurde. Im Gegensatz dazu sind diese Gewebeschnitte aufgrund einer erfolglosen Farbstoffpenetration, eines Mangels an Inselzellen oder einer Fülle von nekrotischem Gewebe auf der Probenoberfläche nicht optimal für die Bildgebung. Hochauflösende Bilder einer Pankreasgewebescheibe können verwendet werden, um verschiedene Regionen des Pankreasgewebes abzugrenzen, wie die Langerhans-Inseln, das Acin-Gewebe oder den Pankreasgang.
Reize können verwendet werden, um funktionell zwischen verschiedenen Inselzellen oder zwischen Insel- und Nicht-Inselzellen zu unterscheiden. Zum Beispiel reagieren Betazellen typischerweise auf eine Glukosestimulation mit quadratischem Puls, indem sie einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Kalziums aufweisen, gefolgt von einer schnellen Kalziumschwingung auf einem anhaltenden Plateau. Im Gegensatz dazu reagieren Nicht-Beta-Zellen mit schnelleren und unregelmäßigeren Schwingungen.
Eine Verzögerung des Beginns des intrazellulären Kalziumanstiegs nach Stimulation sowie die Heterogenität und Verzögerungen zwischen einzelnen Zellen können ebenfalls gemessen werden. Die gleichen Parameter können verwendet werden, um die Deaktivierungsphase zu beschreiben. Hier kann eine schematische Darstellung der intrazellulären Calciumoszillationsdauer, -frequenz und des Prozentsatzes der aktiven Zeit beobachtet werden.
Bei der Bildgebung mit Aufnahmeraten von mehr als 10 Hertz können Kalziumwellen, die sich wiederholt über die Insel ausbreiten, deutlich erkannt werden. Klemmen Sie den gemeinsamen Gallengang so nah wie möglich an den Zwölffingerdarm, um zu verhindern, dass der Ast, der in die Bauchspeicheldrüse eintritt, versehentlich verschlossen wird. Hören Sie auch nicht auf, den Kolben während der Injektion zu drücken, da die Agarose sofort in der Nadel aushärtet.
Die Akute Pankreasgewebeschnitttechnik der Maus kann auch mit der Patch-Clamp-Methode verwendet werden, um Ionenkanalströme und Zugangszytose sowie immunhistochemische Studien und Sekretärinnenstudien zu untersuchen.
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