Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Konfokal laserscanningsmikroskopi av kalciumdynamik i akuta mus pankreasvävnadsskivor
Chapters
Summary April 13th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar beredningen av akuta bukspottkörtelvävnadsskivor och deras användning i konfokal laserscanningsmikroskopi för att studera kalciumdynamik samtidigt i ett stort antal levande celler, under långa tidsperioder och med hög spatiotemporal upplösning.
Transcript
I kombination med levande cellkalciumavbildning möjliggör den akuta bukspottkörtelvävnadsskivastekniken studier av intercellulära vågor och multicellulär funktionell anslutning med hög upplösning under långa tidsperioder. De främsta fördelarna med denna teknik är att den är snabb, bevarar vävnadsarkitekturen och minskar begränsad enzymatisk och mekanisk stress samtidigt som ett högt utbyte av vävnad bibehålls. Genom att upptäcka funktionella och morfologiska förändringar under sjukdomsprogression hjälper denna teknik vår förståelse av bukspottkörtelrelaterade sjukdomar, såsom diabetes.
Denna vävnadsskiva teknik kan tillämpas på hjärn-, hypofys- och binjurevävnader med tonvikt på bevarande av intercellulär kontakt, parakrina interaktioner och vävnadsarkitektur. För att förbereda injektion av agaros i musens bukspottkörtel, fyll en fem milliliter spruta med 40 grader Celsius flytande agaros och utrusta sprutan med en 30 gauge nål. Efter att försiktigt ha täckt nålen med ett lock, placera sprutnålens ände nedåt, med hela volymen agaros under vattenytan, i ett 40 grader Celsius vattenbad.
Bubbla en flaska extracellulär lösning med karbogen, kontinuerligt på is, vid 1,5 ml per minut vid barometertryck och rumstemperatur för att säkerställa syresättning och ett pH på 7,4. För att utföra agarosinjektionen placera en avlivad vuxen mus under ett stereomikroskop och få tillgång till musens buk via laparotomi. Flytta försiktigt tarmen till vänster sida för att exponera den gemensamma gallgången och använd pincett för att något lyfta kanalens duodenala ände för att lokalisera Vaters papill.
Använd en hemostat för att klämma fast gallgången vid duodenalpapillen för att förhindra läckage av agarosen från kanalen till tolvfingertarmen och använd en liten skarp tång för att nå under den gemensamma gallgången för att bryta membranet som fäster kanalen i bukspottkörtelvävnaden. Efter att ha rensat så mycket fett och bindväv från kanalen som möjligt, placera kanalen vinkelrätt på spetsarna på ett par större pincett och tryck ordentligt på sprutkolven, injicera den viskösa flytande agarosen i den proximala änden av den gemensamma gallgången i 20 till 30 sekunder. När vävnaden blir vitaktig och något utspänd, ta bort sprutan och häll långsamt 20 ml av den bubblande iskalla extracellulära lösningen på bukspottkörteln för att kyla vävnaden och härda agarosen.
För att förvärva bukspottkörtelvävnadsskivor använd pincett och fina hårda saxar för att försiktigt överföra den agarosinsprutade bukspottkörteln till en 100 millimeter petriskål innehållande 40 ml iskall extracellulär lösning. Virvla skålen för att skölja vävnaden och överföra bukspottkörteln till en andra skål med iskall extracellulär lösning. Använd tången och saxen för att skära den vitaktiga, välinsprutade bukspottkörtelsektionen i upp till sex bitar på 0,1 till 0,2 kubikcentimeter och ta bort eventuell kvarvarande bindväv och fettvävnad från vävnadsbitarna.
Placera de rengjorda blocken i en 35 millimeter icke-klibbig botten petriskål som innehåller cirka fem milliliter 40 grader Celsius flytande agaros och lägg omedelbart petriskålen på is. När agarosen har härdat, håll petriskålen upp och ner över locket på en 100 millimeter petriskål och använd ena halvan av ett rakblad för att försiktigt skära i marginalen mellan petriskålens sidovägg och agarosen för att ta bort agarosen från skålen. Använd rakbladet för att skära enskilda kuber, var och en innehållande ett vävnadsblock av agaros, från den frigjorda agarosen och använd cyanoakrylatlim för att fästa blocken på provplattan i ett vibratom.
Fyll vibratomets skärkammare med 150 ml iskall extracellulär lösning som kontinuerligt bubblas med karbogen. Skruva fast provplattan på vibratomet och montera ett nytt rakblad. Omge kammaren med is och tillsätt två isbitar med 10 ml volym gjorda med extracellulär lösning kompletterad med sex millimolär glukos.
Ställ in skivaren på 0,05 till 1 millimeter per sekund och 70 hertz och börja sedan skiva för att få 140 mikron tjocka agarosskivor med en yta på 20 till 100 kvadratmillimeter. Använd en fin pensel för att försiktigt överföra varje skiva till en 100 millimeters petriskål fylld med 40 millimeter HEPES-buffert kompletterad med sex millimolar glukos. För beredning av kalciumfärgämne, lös upp 50 mikrogram cellgenomsläppligt kalciumindikatorfärgämne, 7,5 mikroliter DMSO och 2,5 mikroliter av poloxamern och 6,667 ml HBS i ett 15 ml skruvlockrör.
Använd en pipett för att blanda lösningen noggrant i 20 sekunder innan du sänker röret i en ultraljudsbadkammare och virvlar, var och en i 30 sekunder. Sedan alikvotera 3,333 ml av den resulterande kalciumindikatorfärglösningen i en 5 ml petriskål per 10 skivor vävnad som ska märkas. För färgbelastning, använd en tunn mjuk pensel för att överföra upp till 10 vävnadsskivor till varje skål med färglösning och placera diskarna på en orbitalskakare i 50 minuter vid rumstemperatur och 40 varv per minut skyddad från ljus.
Vid slutet av inkubationen överför du upp till 20 färgade skivor till enskilda 60 ml petriskålar fyllda med färgfri HBS. För kalciumavbildning med konfokalmikroskopi välj en 20 eller 25 gånger förstoring och ställ in förvärvsläget till time-lapse-avbildning, pinhålet till 100 till 200 mikron och excitationen och emissionen för fluoroforen som används i experimentet. Montera inspelningskammaren och perfusionssystemet på mikroskopets temperaturstyrda steg och placera inloppet och utloppet på inspelningskammarens bortre kanter.
Ställ in inflödes- och utflödeshastigheterna till en till två milliliter per minut. Ställ in temperaturen på överflödssystemet till 37 grader Celsius och initiera överflöd med den icke-stimulerande lösningen. För att registrera vävnadens kalciumdynamik placera en enda vävnadsskiva i inspelningskammaren och immobilisera vävnaden med en U-formad platinavikt med ett spänt nylonnät.
Använd alternativet för ljusa fält för att hitta strukturen av intresse och använd levande avbildning för att placera de studerade strukturerna i synfältet. För att optimera signal-brusförhållandet, justera lasereffekten, detektorförstärkningen och linjegenomsnittet binning samtidigt som lasereffekten hålls minimal. Justera fokalplanet till 15 mikron under snittytan för att undvika inspelning från potentiellt skadade celler och få bilderna.
Ställa in samplingsfrekvensen till en till två hertz för att möjliggöra initial detektering av enskilda svängningar och spela in en högupplöst bild. Om det är tillgängligt, använd ett online-diagram för att få omedelbar feedback om förberedelsesvaret, överbelysning, fotoblekning och mekanisk drift. När alla bilder har hämtats sparar du data för senare analys.
Här kan ett exempel på en optimal vävnadsskiva observeras där cellgenomsläppligt kalciumindikatorfärgämne framgångsrikt laddades i bukspottkörtelvävnadsskivan. Däremot är dessa vävnadsskivor inte optimala för avbildning på grund av antingen en misslyckad färgpenetration, brist på öceller eller ett överflöd av nekrotisk vävnad på provytan. Högupplösta bilder av en bukspottkörtelvävnadsskiva kan användas för att avgränsa distinkta regioner i bukspottkörtelvävnaden, såsom Langerhans öar, acinär vävnad eller bukspottkörtelkanalen.
Stimuli kan användas för att funktionellt skilja mellan olika öceller eller mellan ö- och icke-ö-celler. Till exempel svarar betaceller vanligtvis på en fyrkantig pulsglukosstimulering genom att uppvisa en övergående ökning av intracellulärt kalcium följt av en snabb kalciumoscillation på en ihållande platå. Däremot svarar icke-betaceller med snabbare och mer oregelbundna svängningar.
En fördröjning i början av intracellulär kalciumökning efter stimulering, liksom heterogeniteten och förseningarna bland enskilda celler kan också mätas. Samma parametrar kan användas för att beskriva avaktiveringsfasen. Här kan en schematisk presentation av den intracellulära kalciumoscillationens varaktighet, frekvens och procentandel av aktiv tid observeras.
Vid avbildning vid förvärvshastigheter större än 10 hertz kan kalciumvågor som upprepade gånger sprider sig över holmen tydligt kännas igen. Kläm fast den gemensamma gallgången så nära tolvfingertarmen som möjligt för att förhindra att grenen som kommer in i bukspottkörteln av misstag täpps till. Sluta inte heller trycka ner kolven under injektionen eftersom agarosen omedelbart härdar i nålen.
Den akuta muspankreasvävnadsskiva tekniken kan också användas med patch clamp-metoden för att studera jonkanalströmmar och få tillgång till cytos samt immunohistokemistudier och sekreterarstudier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
