आनुवंशिक रूप से लक्षित रेटिना सेल आबादी के विरल एडेनो-एसोसिएटेड वायरस लेबलिंग का उपयोग करके न्यूरोनल आर्बराइजेशन का टाइम-लैप्स इमेजिंग

न्यूरोनल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए डेंड्राइटिक या अक्षीय आर्बर्स के एकल-सेल लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन की आवश्यकता होती है। एक न्यूनतम-इनवेसिव तरीके से arbors विकसित लेबलिंग द्वारा, रेटिना ऊतक स्वस्थ रहता है और लंबे समय तक confocal लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त है। इस विधि का मुख्य लाभ इंजेक्शन के बाद चार दिनों के भीतर बहु-रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत arbors की कल्पना करने की क्षमता है।

यह नवजात आर्बर आकृति विज्ञान का अध्ययन संभव बनाता है। इस इंजेक्शन इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल का उपयोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरोनल आकारिकी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उचित Cre चयन और इंजेक्शन स्थान ब्याज की सेल आबादी को लक्षित करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

ब्याज की रेटिना सेल आबादी को लेबल करने के लिए एक क्रे माउस लाइन का चयन करके शुरू करें। recombinase-निर्भर AAV वायरस एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्राप्त करें। ठीक प्रक्रियाओं के इष्टतम लेबलिंग के लिए, वेक्टर का चयन करें जो प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करने वाले संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं।

बर्फ पर AAV एलीकोट के लिए, और बाँझ खारा या पीबीएस का उपयोग करके एक से चार एएवी कमजोर पड़ने की तैयारी करें। इंजेक्शन की कल्पना करने के लिए, एएवी कमजोर पड़ने के प्रत्येक 15 माइक्रोलीटर के लिए 0.02% फास्ट ग्रीन एफसीएफ डाई समाधान के लगभग एक माइक्रोलीटर को जोड़कर समाधान को नीले रंग में रंग दें। 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन क्षेत्र को निष्फल करें।

एक माइक्रोसिरिंज का उपयोग करके एएवी कमजोर पड़ने के साथ माइक्रोपिपेट को बैकफिल करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, टिप को अनसील करने के लिए 30-गेज सुई के साथ माइक्रोपिपेट टिप को तोड़ दें। नवजात चूहों को बेहोश करने के बाद, जानवरों की पहचान करने के लिए 30-गेज सुई का उपयोग करके टैटू स्याही के साथ अपने पंजे पैड को टैटू करें।

डीएनए अलगाव और जीनोटाइपिंग के लिए पूंछ कतरन इकट्ठा. 70% इथेनॉल के साथ आंखों को ओवरलाइंग त्वचा को स्वाब करें। आंख खोलने के लिए उंगलियों के साथ हल्का दबाव लगाते हुए फ्यूज्ड पलक को खोलने के लिए 30-गेज सुई का उपयोग करें।

कॉर्निया स्क्लेरा जंक्शन पर कॉर्निया के माध्यम से एक छोटे से छेद को प्रहार करें। छेद में ग्लास माइक्रोपिपेट डालें और इंट्राविट्रियल स्पेस में एएवी इंजेक्ट करने के लिए माइक्रो इंजेक्टर फुट पेडल को दो से चार बार दबाएं। धीरे-धीरे माइक्रोपिपेट को हटा दें और पुतली में नीले रंग की डाई की कल्पना करके एएवी इंजेक्शन की पुष्टि करें।

पाठ पांडुलिपि में वर्णित रेटिना एसीएसएफ तैयार करने के बाद, कम से कम 15 मिनट के लिए कार्बोजन के साथ बुदबुदाते हुए रेटिना एसीएसएफ को ऑक्सीजन दें, फिर पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। एक 60 मिलीमीटर व्यास पेट्री डिश को एक बर्फ ट्रे में एम्बेड करें और इसे ऑक्सीजनयुक्त रेटिना एसीएसएफ से भरें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत भरे पेट्री पकवान जगह.

अगला, आंख को उजागर करने के लिए euthanized माउस की पलक फ्लैप काटें। आंखों को न्यूक्लिएट करने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें और उन्हें स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखे ठंडे रेटिना एसीएसएफ में स्थानांतरित करें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, ड्यूमोंट नंबर पांच संदंश का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़कर आंख को स्थिर करें और कॉर्निया के केंद्र में 30 गेज सुई के साथ एक छेद को प्रहार करें, फिर छेद से कॉर्निया के अंत तक एक चीरा बनाने के लिए छेद में सूक्ष्म कैंची की एक नोक डालें।

कार्डिनल दिशाओं में चार स्लाइस बनाने के लिए दोहराएं, जिससे चार फ्लैप बन सकें। समझें और दो आसन्न फ्लैप को अलग करें, धीरे से सभी कॉर्निया फ्लैप के लिए रेटिना से स्क्लेरा को छीलते हुए। फिर संदंश का उपयोग करके रेटिना कप से लेंस को हटा दें।

अंत में, ऑप्टिक तंत्रिका की ओर रेटिना के किनारे से चार रेडियल चीरों को बनाने के लिए सूक्ष्म कैंची का उपयोग करें, जिससे चार बराबर पंखुड़ियां बन सकें। यदि बढ़ते के लिए बड़े व्यास के ग्रे एमसीई झिल्ली फिल्टर का उपयोग करते हैं, तो डिस्क को लगभग एक सेंटीमीटर के पार चतुर्भुज में काटें, फिर एमसीई डिस्क को एक बड़े सफेद फिल्टर पेपर के केंद्र पर रखें। शून्य पेंट ब्रश द्वारा दो आकार तीन का उपयोग करते हुए, रेटिना गैंग्लियन सेल साइड के साथ एक पेंट ब्रश पर एक रेटिना कप फ्लिप करें।

धीरे से रेटिना को एसीएसएफ से बाहर निकालें, यह सुनिश्चित करें कि पानी का तनाव रेटिना को फाड़ नहीं देता है। जबकि अभी भी रेटिना के साथ पेंट ब्रश को पकड़े हुए, एसीएसएफ युक्त पेट्री डिश को रास्ते से बाहर ले जाएं और स्टीरियोस्कोप के नीचे एमसीई झिल्ली के साथ सफेद फिल्टर पेपर रखें। एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करते हुए, MCE फ़िल्टर पेपर के केंद्र में ACSF की एक बूंद रखें।

रेटिना को सतह के तनाव और चार्ज किए गए एमसीई झिल्ली द्वारा बनाई गई एसीएसएफ ड्रॉपलेट में फ्लोट करें। रेटिना गैंग्लियन सेल साइड के साथ बूंद के भीतर रेटिना को स्थिति देने के लिए पेंट ब्रश का उपयोग करें, फिर चार पंखुड़ियों को उजागर करें। एक बार तैनात होने के बाद, बूंद की सतह के तनाव को तोड़ने के लिए पेंटब्रश और सफेद फिल्टर पेपर के बीच एक पानी का पुल बनाएं।

लाइव इमेजिंग इनक्यूबेशन कक्ष को इकट्ठा करें और इसे ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ से भरें। पंप और तापमान नियंत्रक को चालू करें, यह सुनिश्चित करें कि तापमान 34 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न बढ़े। कक्ष के तापमान को स्थिर करने में एक घंटे तक का समय लग सकता है।

रेटिना विच्छेदन शुरू करने से पहले इनक्यूबेशन कक्ष स्थापित करने की सिफारिश की जाती है। स्थिर कक्ष तापमान नमूना बहाव को कम करने में मदद करता है। रेटिना फ्लैट टीले को परफ्यूजन चैंबर में स्थानांतरित करने के लिए, पंप को रोकें और कक्ष में मौजूद एसीएसएफ को हटा दें।

फिर रेटिना फ्लैट माउंट के साथ एमसीई डिस्क को इनक्यूबेशन कक्ष में रखें। सतह के तनाव को तोड़ने के लिए एक नमूना वजन को पूर्व-गीला करें, फिर इसे फ्लैट माउंट पर रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि नमूना वजन को नमूना बहाव को कम करने के लिए एमसीई पेपर पर रखा गया है। गर्म एसीएसएफ के साथ कक्ष को फिर से भरें और लगभग एक मिलीलीटर प्रति मिनट पर एसीएसएफ प्रसारित करें।

इमेजिंग कक्ष में 25 बार पानी डुबकी उद्देश्य के साथ nosepiece की स्थिति. एपिफ्लोरोसेंट प्रकाश का उपयोग करके ब्याज की लेबल कोशिकाओं के लिए स्क्रीन, और ब्याज की डेंड्राइटिक विशेषताओं को कैप्चर करने के लिए इमेजिंग वॉल्यूम को समायोजित करें। एक लुकअप टेबल का उपयोग करना जो ओवरसैचुरेटेड और अंडरसैचुरेटेड पिक्सेल दोनों की पहचान करता है, लेजर पावर को समायोजित करें जैसे कि कोई पिक्सेल ओवरसैचुरेटेड न हो।

3 डी इमेजिंग मात्रा प्राप्त करें और वांछित फ्रेम दर पर अधिग्रहण दोहराएं। नमूना बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए इमेजिंग वॉल्यूम को प्रत्येक समय बिंदु के बीच समायोजित किया जा सकता है। छवि श्रृंखला आयात करें, समय के अनुसार छवियों को विभाजित करें।

मैन्युअल रूप से या मैक्रो प्लगइन चलाकर सभी समय बिंदुओं को सहेजें। Defraction PSF 3D, लेंस संख्यात्मक एपर्चर, fluorophore उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, पिक्सेल आकार, और Z-रिक्ति पर क्लिक करके ImageJ प्लगइन का उपयोग करके एक सैद्धांतिक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन बनाएँ एक सटीक PSF बनाने के लिए आवश्यक हैं। प्लगइन्स, मैक्रोका चयन करें, और प्रदान किए गए मैक्रो का उपयोग करके सभी समय बिंदुओं के लिए बैच समानांतर पुनरावर्ती deconvolution करने के लिए चलाएँ।

फ़ाइल, आयात, फिर छवि अनुक्रम पर क्लिक करके स्टैक के रूप में सभी deconvolved समय बिंदुओं को आयात करें। छवि, हाइपरस्टैक पर क्लिक करके स्टैक को हाइपरस्टैक में कनवर्ट करें, फिर हाइपरस्टैक में स्टैक करें। जेड-स्लाइस और समय सीमा की संख्या जोड़ें, फिर सही 3 डी बहाव प्लगइन का उपयोग करके 3 डी बहाव को सही करें।

सहेजें 3 डी बहाव सही hyperstack और छवि, hyperstack, हाइपरस्टैक पर क्लिक करके एक नियमित स्टैक के लिए छवि वापस कनवर्ट करने के लिए ढेर, तो छवि, ढेर, उपकरण, और स्टैक विभाजक क्लिक करके समय बिंदुओं को विभाजित करें। विभाजित करने के लिए substacks की संख्या के लिए, समय बिंदुओं की संख्या दर्ज करें। सभी समय बिंदुओं के लिए अधिकतम प्रक्षेपण बनाने के लिए बैच प्रोसेसिंग का उपयोग करें।

फ़ाइल, आयात, फिर छवि अनुक्रम पर क्लिक करके समय अंतराल छवि अनुक्रम आयात करें। और deconvolved और पोस्ट संसाधित दो आयामी वीडियो के वांछित विश्लेषण के लिए पारंपरिक ImageJ उपकरण का उपयोग करें, starburst सेल डेंड्राइट्स के विकास का एक उच्च संकल्प 3 डी वीडियो का अधिग्रहण किया गया था, deconvolved, और 3 डी बहाव के लिए सही किया गया था। विश्लेषण के लिए 2 डी वीडियो बनाने के लिए जेड-प्लेन अधिकतम अनुमानों का उत्पादन किया गया था, जिसमें डेंड्राइटिक शोधन का एक क्षेत्र और डेंड्राइटिक आउटग्रोथ का एक क्षेत्र दिखाया गया था।

प्रत्येक समय बिंदु के 3 डी deconvolution से पहले और ImageJ के साथ deconvolution के बाद एकल P6 starburst amacrine सेल के ठीक filopodia अनुमानों के संकल्प में वृद्धि हुई. लंबे समय तक एएवी संक्रमण की अवधि जरूरी नहीं कि फ्लोरोसेंट सिग्नल में वृद्धि हो, जैसा कि इंजेक्शन के बाद पांच और 11 दिनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति के समान स्तर ों द्वारा दिखाया गया है। इमेजिंग के दौरान नमूना बहाव को कम करना महत्वपूर्ण है।

बहाव को एक सुसंगत इमेजिंग तापमान को बनाए रखने और नमूने पर वजन को उचित रूप से स्थिति देकर कम से कम किया जाता है। यदि बहाव होता है, तो समय श्रृंखला का मैनुअल अधिग्रहण फ्रेम के बीच इमेजिंग वॉल्यूम के समायोजन के लिए अनुमति देता है। यह सुनिश्चित करता है कि ब्याज की विशेषताएं फ्रेम में रहती हैं।

यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन, deconvolved, और बहाव-सही 3 डी न्यूराइट्स के विकास के वीडियो का उत्पादन करता है। इस तरह के वीडियो न्यूरॉन वायरिंग की बेहतर समझ का कारण बनते हैं और 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण विधियों को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं। बेहतर स्वचालित अनुरेखण और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर neurite विकास के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।