Biochemistry
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एक समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में नमूना समर्थन फिल्मों की तैयारी
Chapters
Summary April 8th, 2021
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क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) के लिए नमूना तैयारी इस विधि की संरचना निर्धारण वर्कफ़्लो में एक महत्वपूर्ण बाधा है। यहां, हम संचरण ईएम अध्ययनों के लिए नमूनों को स्थिर करने के लिए समर्थन फिल्मों की तैयारी के लिए एक आसान-से-उपयोग, तीन-आयामी मुद्रित ब्लॉक का उपयोग करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं।
Transcript
यहां हम एक उपन्यास फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके समर्थन फिल्मों के साथ क्रायो-ईएम नमूने तैयार करने के लिए बेहतर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो इस तरह की नाजुक फिल्मों को संभालने की सुविधा प्रदान करता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि नमूना हवा के पानी के इंटरफ़ेस से संरक्षित है जहां विकृतीकरण जैसे हानिकारक प्रभाव हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में से एक ग्राफिंग हाइड्रोफिलिक को प्रस्तुत करने के लिए किसी भी प्रकार के महंगे उपचार से बचता है, इसलिए पूरे ईएम समुदाय के लिए इसकी पहुंच बढ़ जाती है।
छोटे फ्लोटेशन उपकरणों को अभी तक अच्छी तैयारी के लिए इलेक्ट्रो माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। तो ये दृश्य प्रदर्शन उनके उपयोग के लिए एक बेंचमार्क प्रदान कर सकते हैं। शुरू करने के लिए, डबल आसुत पानी और एथेल एसीटेट के साथ TEM ग्रिड को धोएं, जिसके बाद प्लाज्मा सफाई होती है।
फिर बफर एक्सचेंज में नमूने के 10 से 12 माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से जोड़ें, फ्लोटेशन ब्लॉक और 2% मूत्रकालीन एसीटेट समाधान के 10 से 12 माइक्रोलीटर आसन्न गैर-बफर विनिमय में नकारात्मक धुंधला के लिए अच्छी तरह से। दाग के साथ काम करते समय उचित सुरक्षा सावधानियां बरतना आवश्यक है। ध्यान से शीर्ष पर पूर्व जमा कार्बन फिल्म के साथ अभ्रक के दो छोटे टुकड़े काटें।
सुनिश्चित करें कि अभ्रक के टुकड़े अच्छी तरह से फिट होने के लिए पर्याप्त चौड़े हैं और अच्छी तरह से लंबाई से अधिक समय तक, जैसे कि कार्बन तैरते समय टुकड़ा कुएं पर बैठ सकता है और चिमटी के साथ टुकड़े को संभालने के लिए पर्याप्त जगह है। अभ्रक को 45 डिग्री के अनुमानित कोण के साथ कुएं में विसर्जित करें जब तक कि अभ्रक कुएं के रैंप पर नहीं बैठता है और कार्बन परत तरल नमूने की सतह पर देखी जाती है। नमूने के साथ कार्बन incubating के बाद, अभ्रक शीट बहुत धीरे धीरे वापस लेने के लिए कार्बन फिल्म को ठीक करने के लिए और अवशिष्ट viscus नमूना प्रतिधारण को कम करने के लिए.
अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक फिल्टर पेपर के साथ निचले गैर-कार्बन सतह को टैप करके अभ्रक को ध्यान से धब्बा करें और नकारात्मक दाग के साथ कार्बन परत का आदान-प्रदान करने के लिए 2% मूत्र आहार एसीटेट समाधान युक्त विरोधी अच्छी तरह से अभ्रक टुकड़े को विसर्जित करें। धोया और प्लाज्मा साफ ईएम ग्रिड के पवित्र कार्बन कवर पक्ष के साथ फ्लोटिंग कार्बन परत को पुनर्प्राप्त करें। फिर टीईएम पर इमेजिंग तक ग्रिड को हवा में सूखने के लिए छोड़ दें, अधिमानतः हवाई संदूषण से बचने के लिए उन्हें कवर करें।
पहले के रूप में प्रदर्शित के रूप में TEM ग्रिड की सफाई के बाद, graphene ऑक्साइड निलंबन बस का उपयोग करने से पहले तैयार और भंवर अच्छी तरह से. फिर चार गैर बफर विनिमय कुओं में graphene ऑक्साइड निलंबन के 10 से 12 microliters जोड़ें। फ्लोटेशन ब्लॉक के साथ।
ब्लॉक के शेष चार बफर एक्सचेंज कुओं में डबल आसुत पानी या अल्ट्रा शुद्ध पानी के 10 से 12 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से graphene ऑक्साइड निलंबन पर धीरे से चार ग्रिड ड्रॉप और एक मिनट के लिए इनक्यूबेट यह सुनिश्चित करने के लिए कि पवित्र कार्बन कवर पक्ष समाधान के साथ संपर्क में है. एक मिनट के बाद, प्रत्येक गैर बफर एक्सचेंज के चिमटी नाली में चिमटी स्लाइडिंग द्वारा प्रत्येक ग्रिड को ध्यान से पुनर्प्राप्त करें।
धीरे से और संक्षेप में आसन्न अच्छी तरह से डबल आसुत पानी के साथ प्रत्येक ग्रिड के तांबे के गैर कार्बन कवर पक्ष को झुकाएं जब तक कि पानी की बूंद ग्रिड पर दिखाई न दे। फिर ध्यान से ग्रिड पानी ड्रॉप को फ़िल्टर पेपर के एक टुकड़े के खिलाफ उल्टा रखें। ग्रिड को कवर करें और उन्हें हवा सूखने के लिए चिमटी में छोड़ दें।
ग्लास स्लाइड पर जमा तांबे की ग्राफिंग शीट के शीर्ष पर चार वॉश ग्रिड रखें, और मोनोलेयर ग्राफीन और ग्रिड के बीच अंतरंग संपर्क की अनुमति देने के लिए आइसोप्रोपेनोल की एक बूंद के साथ प्रत्येक ग्रिड को कवर करें। isopropanol के पूर्ण वाष्पीकरण के बाद, ग्लास पेट्री डिश में फेरिक क्लोराइड समाधान पर ग्रिड के साथ तांबे graphene शीट फ्लोट। फिर एयरबोर्न संदूषण से बचने के लिए पकवान को कवर करें और इसे रात भर कमरे के तापमान पर एच करने के लिए छोड़ दें।
GRAPHENE मोनोलेयर पर तैरने वाले ग्रिड को बाहर निकालने के लिए TEM ग्रिड आकार से बड़े व्यास के साथ एक लूप का उपयोग करें और सावधानीपूर्वक उन्हें धोने के लिए डबल आसुत पानी युक्त ग्लास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पानी में दो बार ग्रिड धोएं और नमूना तैयारी और डुबकी ठंड तक नमूना बफर युक्त एक पेट्री डिश में ग्रिड को स्थानांतरित करें। फ्लोटेशन ब्लॉक के एक कुएं में नमूने के 10 से 12 माइक्रोलीटर जोड़ें।
जब नमूना ब्लॉक में तैयार हो जाता है, तो साफ चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके बफर समाधान से ग्राफीन लेपित ग्रिड चुनें और इसे अच्छी तरह से युक्त नमूने की सतह पर रखें। एक उपयुक्त इनक्यूबेशन अवधि के बाद, साफ ठंड चिमटी की एक जोड़ी के साथ ग्रिड उठाओ और ब्लोटिंग और विट्रीफिकेशन के साथ आगे बढ़ें। समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक के साथ तैयार नकारात्मक रूप से दाग वाले ग्रिड आमतौर पर पूरे ग्रिड सतह पर अनाकार कार्बन के साथ कवर किए जाते हैं।
जबकि कार्बन फिल्म का टूटना कुछ उदाहरणों में होता है, बड़ी संख्या में ग्रिड वर्ग प्राचीन होते हैं और इसलिए नकारात्मक धुंधला उद्देश्यों के लिए लागू होते हैं। इसी तरह, अच्छी फिल्म कवरेज नियमित रूप से graphene ऑक्साइड प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूरे ग्रिड भर में प्राप्त की जाती है। Graphene ऑक्साइड ग्रिड कच्चे माल से जल्दी से तैयार किया जा सकता है और नमूने के अत्यधिक सुरक्षात्मक हैं।
ठंड से ठीक पहले graphene गीला और नमूना आवेदन सीटू में रखना क्रायो-ईएम के लिए उपयुक्त बर्फ परतों उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। इस प्रोटोकॉल graphene हाइड्रोफिलिक रेंडर करने के लिए उपकरण की आवश्यकता नहीं है और नमूना वसूली के लिए एक लाभ प्रदान करता है। समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक में प्रत्येक अच्छी तरह से की साइट पर दो सुई बंदरगाह होते हैं जो बफर को सी 2 में विस्तारित करने की अनुमति देते हैं जो ग्लिसरॉल ग्रेडिएंट से प्राप्त नमूनों के लिए बहुत उपयोगी है।
फ्लोटेशन ब्लॉक ने छोटे वॉल्यूम के नियंत्रणीय बफर प्रवाह का उपयोग करके ग्रिड आत्मीयता शुद्धिकरण विधियों की खोज को सक्षम किया है, साथ ही कार्यात्मक समर्थन फिल्मों का भी उपयोग किया है।
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