Biochemistry
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使用支撑浮块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜
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Summary April 8th, 2021
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冷冻电子显微镜（cryo-EM）的样品制备是该方法结构测定工作流程中的一个重大瓶颈。在这里，我们提供了使用易于使用的三维打印块制备支撑膜的详细方法，以稳定样品以进行透射EM研究。
Transcript
在这里，我们提出了改进的方案，以使用新颖的浮选块制备带有支撑膜的冷冻电镜样品，该浮选块有助于处理这种脆弱的薄膜。这种方法的主要优点是样品受到保护，免受空气水界面的影响，其中可能发生变性等破坏性影响。这里介绍的协议之一避免了任何昂贵的处理来使图形亲水，从而增加了其对整个EM社区的可访问性。
小型浮选装置尚未被电显微镜广泛用于良好的制备。因此，这些视觉演示可以为它们的使用提供基准。首先，用双蒸馏水和醋酸乙二醇盐清洗TEM网格，然后进行等离子清洗。
然后将10至12微升样品加入缓冲液交换孔，浮选块和10至12微升2%尿苷醋酸盐溶液中，进入相邻的非缓冲液交换孔中进行阴性染色。处理污渍时，必须采取适当的安全预防措施。小心地切下两小块云母，上面有预先沉积的碳膜。
确保云母碎片足够宽，可以放入井中并且比孔的长度更长，这样碎片就可以在碳漂浮时坐在井上，并且有足够的空间用镊子处理碎片。将云母以近似45度的角度浸入孔中，直到云母位于孔的斜坡上，并在液体样品的表面观察到碳层。将碳与样品一起孵育后，非常缓慢地取出云母片，以回收碳膜并最大限度地减少残留的粘性样品。
用滤纸敲击下部非碳表面以除去多余的液体，并将云母碎片浸入含有2%小便池醋酸盐溶液的相对孔中，以与负染色剂交换碳层，从而小心地吸印云母。回收漂浮的碳层，并用洗涤和等离子清洗的EM网格的神圣碳覆盖面。然后将网格风干，直到TEM成像，最好覆盖它们以避免空气污染。
如前所述清洁TEM网格后，在使用前准备氧化石墨烯悬浮液并彻底涡旋。然后将10至12微升氧化石墨烯悬浮液加入四个非缓冲交换孔中。沿着浮选块。
将10至12微升双蒸馏水或超纯水加入块的其余四个缓冲液交换井中。将四个网格轻轻地滴到每个孔的氧化石墨烯悬浮液上，并孵育一分钟，以确保圣碳覆盖的一侧与溶液接触。一分钟后，通过将镊子滑入每个非缓冲交换孔的镊子槽中，仔细恢复每个网格。
用相邻井中的双蒸馏水轻轻地、短促地轻推每个网格的铜非碳覆盖侧，直到网格上可以看到水滴。然后小心地将网格水滴倒置在一张滤纸上。盖上网格，将它们放在镊子中风干。
将四个洗涤网格放在沉积在载玻片上的铜图形片的顶部，并用一滴异丙醇覆盖每个网格，以允许单层石墨烯和网格之间的紧密接触。在异丙醇完全蒸发后，将带有网格的铜石墨烯片漂浮在玻璃培养皿中的氯化铁溶液上。然后盖上培养皿以避免空气污染，并将其在室温下蚀刻过夜。
使用直径大于TEM网格尺寸的环将漂浮在石墨烯单层上的网格捞出，并小心地将它们转移到含有双蒸馏水的玻璃培养皿中进行洗涤。在水中洗涤网格两次，然后将网格转移到含有样品缓冲液的培养皿中，直到样品制备并急剧冷冻。将10至12微升样品加入浮选块的孔中。
当样品在块中准备就绪时，使用一对干净的镊子从缓冲溶液中选取石墨烯涂层网格，并将其放置在含有孔的样品的表面上。经过适当的孵育期后，用一对干净的冷冻镊子拿起网格，然后进行印迹和玻璃化。用支撑浮选块制备的负染色网格通常在整个网格表面上覆盖着无定形碳。
虽然在某些情况下会发生碳膜的断裂，但大量的网格方块是原始的，因此适用于负染色目的。同样，使用氧化石墨烯方案在整个网格中通常实现良好的薄膜覆盖率。氧化石墨烯网格可以从原料中快速制备，并且对样品具有高度的保护性。
在冷冻前将石墨烯保持湿润并就位样品应用足以产生适合冷冻电镜的冰层。该协议不需要设备来使石墨烯亲水，并且为样品回收提供了优势。支撑浮选块在每个孔的位点有两个针端口，允许缓冲液在C2中延伸，这对于从甘油梯度衍生的样品非常有用。
浮选块通过利用小体积的可控缓冲液流以及功能化的支撑膜，使对网格上亲和纯化方法的探索成为可能。
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