Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
إعداد عينات من أفلام الدعم في المجهر الإلكترون الإرسال باستخدام كتلة دعم التعويم
Chapters
Summary April 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
إعداد عينة للجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) هو عنق الزجاجة كبيرة في سير عمل تحديد هيكل هذه الطريقة. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام سهلة الاستخدام، كتلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لإعداد أفلام الدعم لتحقيق الاستقرار في عينات لدراسات EM الإرسال.
Transcript
هنا نقدم بروتوكولات محسنة لإعداد عينات cryo-EM مع أفلام الدعم باستخدام كتلة تعويم جديدة تسهل التعامل مع مثل هذه الأفلام الحساسة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن العينة محمية من واجهة مياه الهواء حيث يمكن أن تحدث آثار ضارة مثل التشبع. واحد من البروتوكولات المعروضة هنا يتجنب أي نوع من العلاج مكلفة لجعل الرسم البياني hydrophilic، وبالتالي زيادة إمكانية الوصول إلى المجتمع EM كله.
لا تستخدم أجهزة التعويم الصغيرة على نطاق واسع بعد من قبل المجهر الكهربائي لإعداد جيد. لذلك يمكن أن توفر هذه المظاهرات البصرية معيارا لاستخدامها. للبدء، وغسل شبكات TEM مع الماء المقطر المزدوج وخلات إيثيل تليها تنظيف البلازما.
ثم إضافة 10 إلى 12 ميكرولتر من العينة في تبادل العازلة جيدا، كتلة التعويم و 10 إلى 12 ميكرولتر من محلول خلات المبولة 2٪ في تبادل غير العازلة المجاورة جيدا لتلطيخ السلبية. من الضروري اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة عند التعامل مع البقع. قطع بعناية قطعتين صغيرتين من الميكا مع فيلم الكربون predeposited على القمة.
تأكد من أن شظايا الميكا واسعة بما يكفي لتناسب البئر وأطول من طول البئر ، بحيث يمكن للجزأة الجلوس على البئر أثناء تعويم الكربون وهناك مساحة كافية للتعامل مع الجزء بالملاقط. تزج الميكا في البئر مع زاوية تقريبية من 45 درجة حتى الميكا يجلس على منحدر البئر ويلاحظ طبقة الكربون على سطح العينة السائلة. بعد احتضان الكربون مع عينة، سحب ورقة الميكا ببطء شديد لاسترداد فيلم الكربون وتقليل الاحتفاظ بالعينات viscus المتبقية.
لطخة بعناية الميكا عن طريق التنصت على سطح أقل غير الكربون مع ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد وتزج جزء الميكا في البئر المعارضة التي تحتوي على 2٪ محلول خلات المبولة لتبادل طبقة الكربون مع وصمة عار سلبية. استعادة طبقة الكربون العائمة مع الكربون المقدسة تغطي الجانب من شبكة EM غسلها والبلازما تنظيفها. ثم اترك الشبكات لتجف حتى يجف التصوير على TEM ، ويفضل أن تغطيها لتجنب التلوث المحمول جوا.
بعد تنظيف شبكات TEM كما هو موضح سابقا، قم بإعداد تعليق أكسيد الجرافين قبل الاستخدام مباشرة ودوامة جيدا. ثم أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من تعليق أكسيد الجرافين في آبار التبادل الأربعة غير العازلة. على طول كتلة التعويم.
أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج أو المياه النقية للغاية في آبار التبادل العازلة الأربعة المتبقية في الكتلة. إسقاط أربع شبكات بلطف على تعليق أكسيد الجرافين من كل بئر واحتضان لمدة دقيقة واحدة لضمان أن الجانب المغطى بالكربون المقدس على اتصال مع الحل. بعد دقيقة واحدة، واستعادة كل شبكة بعناية عن طريق انزلاق الملاقط في الأخدود ملاقط من كل تبادل غير العازلة جيدا.
دفع بلطف ولفترة وجيزة الجانب النحاس غير الكربون المغطاة من كل شبكة مع الماء المقطر مزدوجة في البئر المجاورة حتى قطرة من الماء مرئيا على الشبكة. ثم عقد بعناية المياه الشبكة إسقاط رأسا على عقب ضد قطعة من ورقة التصفية. تغطية الشبكات وتركها في ملاقط للهواء الجاف.
ضع أربع شبكات غسيل فوق ورقة رسم نحاسي مترسبة على شريحة زجاجية ، وقم بتغطية كل شبكة بقطر من الأيزوبروبانول للسماح بالاتصال الحميم بين الجرافين أحادي الطبقة والشبكة. بعد التبخر الكامل للisopropanol، تعويم ورقة الجرافين النحاس مع الشبكات على محلول كلوريد الحديديك في طبق بيتري الزجاج. ثم قم بتغطية الطبق لتجنب التلوث المحمول جوا واتركه للحفر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
استخدام حلقة مع قطر أكبر من حجم الشبكة TEM لصيد الأسماك خارج الشبكات العائمة على طبقة أحادية الجرافين ونقلها بعناية إلى طبق بيتري الزجاج الذي يحتوي على الماء المقطر مزدوجة لغسل. غسل الشبكات مرتين في الماء ونقل الشبكات إلى طبق بيتري تحتوي على عينة عازلة حتى إعداد العينة ويغرق تجميد. أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من العينة في بئر من كتلة التعويم.
عندما تكون العينة جاهزة في الكتلة، اختر الشبكة المغلفة بالجرافين من محلول المخزن المؤقت باستخدام زوج من الملاقط النظيفة ووضعها على سطح العينة التي تحتوي على بئر. بعد فترة حضانة مناسبة، التقط الشبكة بزوج من ملاقط التجميد النظيفة وامضي قدما في النشاف والتزجيج. عادة ما يتم تغطية الشبكات الملطخة سلبا المعدة مع كتلة تعويم الدعم بالكربون غير المتبلور عبر سطح الشبكة بأكمله.
في حين يحدث كسر فيلم الكربون في بعض الحالات ، فإن عددا كبيرا من مربعات الشبكة بكر وبالتالي قابلة للتطبيق لأغراض التلطيخ السلبية. وبالمثل ، يتم تحقيق تغطية جيدة للفيلم بشكل روتيني عبر الشبكة بأكملها باستخدام بروتوكول أكسيد الجرافين. يمكن إعداد شبكات أكسيد الجرافين بسرعة من المواد الخام وهي شديدة الحماية للعينة.
الحفاظ على الجرافين الرطب وتطبيق عينة في الموقع قبل التجميد يكفي لتوليد طبقات الجليد مناسبة لالتبريد م. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات لجعل هيدروفيلي الجرافين ويوفر ميزة لاستعادة العينة. كتلة دعم التعويم واثنين من منافذ إبرة في موقع كل بئر التي تسمح تمديد العازلة في C2 وهو مفيد جدا للعينات المستمدة من التدرجات الجلسرين.
وقد مكنت كتلة التعويم استكشاف على أساليب تنقية تقارب الشبكة من خلال استخدام تدفق العازلة التي يمكن التحكم فيها من كميات صغيرة، فضلا عن أفلام الدعم وظيفية.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
